一种EAAT2基因cRNA原位杂交的探针及其设计方法技术

技术编号:7613960 阅读:336 留言:0更新日期:2012-07-26 22:56
本发明专利技术公开了一种EAAT2基因cRNA原位杂交的探针及其设计方法,按照如下步骤:(1)根据EAAT2的Gene?bank序列我们设计EAAT2特异的引物,并且此对引物扩增出278bp的EAAT2片段作为EAAT2特异的探针序列;(2)构建EAAT2的cRNA原位杂交的探针质粒;将探针质粒转化细菌后,细菌培养后进行测序;(3)制备EAAT2的cRNA原位杂交探针;(4)检测EAAT2的cRNA探针的原位杂交。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物医学领域,涉及一种探针及其设计方法,尤其是一种EAAT2基因 cRNA原位杂交的探针及其设计方法。
技术介绍
谷氨酸是哺乳动物中枢神经系统最重要的神经递质,在体内主要与亲离子性和亲代谢性两种谷氨酸受体家族结合发挥活化作用。谷氨酸如果在细胞外浓度过高,过度兴奋谷氨酸受体可导致神经细胞死亡,由于细胞外没有能分解谷氨酸的酶,释放的谷氨酸几乎完全依赖神经元以及神经胶质细胞膜上的谷氨酸转运蛋白(EAAT)的摄取来保持浓度的相对稳定,同时EAAT也为体内很多代谢途径提供谷氨酸来源。谷氨酸转运蛋白分高亲合力和低亲合力转运蛋白两种,高亲合力转运蛋白都作用于依赖钠-钾的L-谷氨酸,L-和 D-天冬氨酸,所以也称为钠-钾谷氨酸转运蛋白或兴奋性氨基酸转运蛋白(Excitatory amino acid transporter, EAAT)。目前已有五种被克隆,它们是 EAATl (GLAST, Glutamate-aspartate transporter), EAAT2(GLT, glial glutamate transporter), EAAT3(EAAC, excitatory amino acid Carrier), EAAT4 和 EAAT5。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供。本专利技术的目的是通过以下技术方案来解决的一种EAAT2基因cRNA原位杂交的探针,该探针的序列为5 ' AACCAAGGCAGTCATCTCCCTGTTGAATGAGACCATGAATGAGGCCCCTGAAGAAACTAAGATCG TTATCAAGAAGGGCCTGGAGTTCAAGGACGGGATGAATGTCTTAGGTCTGATTGGATTCTTTATTGCTTTCGGCAT TGCCATGGGGAAGATGGGTGAGCAGGCCAAGCTGATGGTGGAGTTCTTCAACATTCTGAACGAGATTGTCATGAAG TTAGTGATCATGATCATGTGGTATTCCCCGCTGGGTATCGCCTGCTTGATCTGTGGGAAGATCATCGCCATCAAG GACTT 3'。所述探针的设计方法(I)根据EAAT2的Gene bank序列我们设计了 EAAT2特异的引物,并且此对引物扩增出278bp的EAAT2片段作为EAAT2特异的探针序列;(2)构建EAAT2的cRNA原位杂交的探针质粒;将探针质粒转化细菌后,细菌培养后进行测序;⑶EAAT2的cRNA原位杂交探针; (4)检测EAAT2的cRNA探针的原位杂交。所述步骤⑴中EAAT2特异的引物是上游引物是5' CAACCAAGGCAGTCATCTCC 3';下游引物是5' AAGTCCTTGATGGCGATGAT 3'。所述步骤(2)按照如下步骤进行(a)将大鼠的cDNA用设计的弓丨物进行PCR扩增;(b)将PCR产物用TIANGEN胶回收试剂盒进行胶回收;(c)将回收后的产物于4°C与多克隆位点两端具有T7,SP6启动子的载体进行连接;(d)将连接好的质粒转化细菌后,细菌培养后进行测序。所述步骤(3)按照如下步骤进行(a)步骤⑵得到的细菌测序正确后,经判断确认EAAT2探针序列插入载体的顺序是正向的;(b)需要使用BamH I限制性内切酶对质粒进行酶切;(c)将酶切产物用TIANGEN胶回收试剂盒进行胶回收;(d)用SP6 RNA聚合酶对探针进行体外转录标记。所述步骤(4)按照如下步骤进行(a)将大鼠用O. 4戍巴比妥纳深麻后,经左心室插管至升王动脉,用O. Olmol/ L的DEPC-PBS的快速冲洗去除血液,再以4 %多聚甲醛灌注固定;所述的O. 01mol/L DEPC-PBS是2. 9克磷酸氢二钠,O. 29克磷酸二氢钠,9. O克氯化钠用超纯水定容至IL后,再加入体积百分比为O. 1%的DEPC Iml放置过夜后,高压灭菌制成的磷酸盐缓冲液;所述4% 的多聚甲醛是40. O克多聚甲醛加入500. Oml蒸馏水加热使之解聚溶解后,再加入500. Oml 的O. 2mol/L PB缓冲液定容至IOOOml ;所述O. 2mol/L PB缓冲液是用29. 01克磷酸氢二钠, 2. 96克磷酸二氢钠加超纯水定容至500ml配制而成;(b)取材后进行脑组织的后固定于4°C,用4%的多聚甲醛后固定24小时;(c)将固定好的组织进行切片将组织切成25 30 μ m组织切片,并将切好的切片保存于O. 01mol/L的DEPC-PBS中,放于4°C冰箱备用;(d)将切好的组织片用O. 01mol/L的DEPC-PBS清洗I次,室温,每次5-10分钟;(e)将上述清洗过的片子用5x SSC清洗2次,室温,每次5_10分钟;所述5x SSC 是由20x SSC用超纯水稀释的,20x SSC为一种柠檬酸缓冲液;(f)将5x SSC清洗后的组织片浸入预杂交液中,于55°C,在杂交炉孵育1_2小时; 所述预杂交液是由5ml的去离子甲酰胺,2. 5ml的20x SSC溶液,200μ I的50x Denhardt’s 溶液,50 μ I的浓度为200mg/ml的Heparin溶液,100 μ I的浓度为10mg/ml的tRNA溶液, 100 μ I的浓度为10%的CHAPS溶液,100 μ I的浓度为10 %的Tween-20溶液,100 μ I的浓度为0. 5mol/L的pH8. O的EDTA溶液和I. 85ml的DEPC-H2O混合配制而成;所述50x DenhardtJ s为一种常用的杂交试剂;所述200mg/ml的Heparin为200mg的Heparin粉末溶于Iml的DEPC-H20中配制而成;所述10mg/ml的tRNA为IOmg的tRNA粉末溶于Iml的 DEPC-H20中配制而成;所述10%的CHAPS为Ig的CHAPS溶于Iml的DEPC-H20中配制而成;所述10%的Tween-20为100 μ I的Tween-20溶于900 μ I的DEPC-H20中配制而成;所述0. 5mol/L的pH8. O的EDTA为186. Ig 二水乙二胺四乙酸二钠加入800ml的DEPC-H20中在磁力搅拌器上剧烈搅拌,用NaOH调pH值至8. O然后定容至IL配制而成高压灭菌备用; 所述DEPC-H2O为IL超纯水加入体积百分比为0. 1%的DEPC 1ml,放置过夜并高压灭菌处理后的水;(g)将预杂交孵育后的组织切片浸入杂交液中,于55°C,在杂交炉中孵育16-20小时;所述杂交液是上述预杂交液中加入终浓度为I. Oug/ml的cRNA探针配置成的;(h)杂交后用Ix SSC洗涤杂交的组织切片,37°C,2次,每次10分钟;⑴用2x SSC洗涤上述的组织切片,37°C,2次,每次10-15分钟;(j)用 10ug/ml 的 RNase A 处理,37。。,I 次,每次 30-40 分钟;(k)用2x SSC洗涤上述的组织切片,室温,I次,每次10分钟;(I)用0. Olmol/L PBS洗涤上述的组织切片,室温,I次,每次10分钟;所述0.01mol/L PBS是2. 9克磷酸氢二钠,0. 29克磷酸二氢钠,9. 0克氯化钠用超纯水定容至I本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员:李俊杰窦科峰赵威李霄
申请(专利权)人:中国人民解放军第四军医大学
类型:发明
国别省市:

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