一种ＨＩＶ侵染细胞的筛选系统及其应用技术方案

本发明专利技术提供了一种ＨＩＶ侵染细胞的筛选系统。由报告蛋白基因一分为二成报告基因Ｎ端和报告基因Ｃ端，报告基因Ｎ端与具有蛋白剪接功能的ＤｎａＥ内含肽Ｎ端基因部分ｄｎａｅ－Ｎ融合构成表达载体Ｉ；报告基因Ｃ端则与具有蛋白剪接功能的ＤｎａＥ内含肽Ｃ端基因部分ｄｎａｅ－Ｃ融合构成表达载体ＩＩ。将两个表达载体分别转染含趋化因子和ＣＤ４蛋白或者含ＨＩＶ包膜蛋白Ｅｎｖ的ＨＥＫ２９３细胞或ＣＨＯ细胞，并构建成稳定表达细胞株。当两株稳定细胞混合培养时，细胞发生融合，从而促使ＤｎａＥ－Ｃ和ＤｎａＥ－Ｎ能够相互接触作用，而由ＤｎａＥ－Ｎ和ＤｎａＥ－Ｃ共同作用把报告蛋白Ｎ端和报告蛋白Ｃ端连接成一个完整的报告蛋白，最后通过检测报告蛋白活性便可知细胞的融合程度。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种模拟HIV侵染细胞的细胞-细胞融合的药物篩选系统，及其在筛选趋化因子CCR5和CXCR4拮抗剂中的应用。(二)
技术介绍
fflV的包膜糖蛋白基因e打v在编码成mRNA后，在Rev蛋白的作用下从被侵染的细胞核内运输至细胞质中，然后在糙面内质网上合成前体蛋白gpl60;gpl60在其内部gp41域上的信号肽引导下随即进入内质网腔内，并发生分子内二硫键的形成，寡聚化，gpl20域部分高度的糖基化修饰；在从内质网转往高尔基#^的过程中，gpl60前体蛋白在宿主蛋白酶(fUrinor a forin-like enzyme )的作用下，发生切割，形成成熟的包膜糖蛋白gpl20和跨膜糖蛋白gp41复合体。包膜糖蛋白复合体以三聚体的形式通过gp41锚定在细胞膜上，gp41与gpl20之间通过非共价键连接。fflV侵染细胞的第一步是gpl20识别被侵染细胞的人分化抗原4蛋白CD4。结合细胞的CD4蛋白后，gpl20的构象发生转变，导致辅助受体CCR5或者CXCR4进一步结合上述复合体，使得gp41发生进一步的构象变化，引起gp41参与的fflV包膜与被侵染细胞的结合最终引起膜融合。传统的筛选CCR5拮抗剂方法是I125标记的配体结合测试法。但是最近的研究发现，配体结合测试法获得CCR5潜在拮抗剂或者抗体在抗病毒作用分析方法获得的结果成不相关性。由于HIV病毒对实-险操作者潜在的感染性，通过抗病毒侵染法大规模筛选HIV侵染抑制剂显得不切实目前已经有报道了多种模拟HIV病毒-细胞融合的替代检测方法。大体上可以分为两大类j艮fflV病毒-细胞融合测试法和细J包-细月包融合法。假HIV病毒-细胞融合测试法是通过弱化的HIV病毒或者其它带有fflV包膜糖蛋白的病毒粒子作为融合载体。这种方法的缺陷在于每次分析需要准备新的病毒粒子，并且耗费很长的孵育时间。这使得难以运用于大规才莫筛选试验。细胞-细胞融合测试法基于人类细胞在被fflV病毒侵染后能够与未发生侵染的细胞发生融合，并且这种融合方式的机理类似与病毒侵染细胞的方式。运用不同的细胞系和融合4佥测方法，目前已经有许多测试方法，这其中包括1、通过细胞膜和细胞核染色来观察细胞-细胞间的融合，该方法冗长的操作步骤不适用于大规模药物筛选试验。2、通过细胞融合后转录激活信号基因的表达来检测细胞的融合，该方法已经有运用于大规模筛选试验，但是由于通过信号蛋白转录激活需要耗费一定时间，因此筛选时间有待提高。内含肽(intein)是来自细菌的蛋白翻译产物(前体蛋白)阅读框架内的一段氨基*列，它靠自我剪切的方式从前体蛋白中释放出来，同时以肽键将两端肽链相连形成成熟蛋白的方式介导蛋白质剪接(splicing)。1998年报道的来自蓝藻S;vec/wc泡sp. PCC6803的DnaE intein是一种内含肽，其N端和C端剪接结构域的基因被750kb的基因组序列分开，蛋白翻译产物仍可以通过内含肽片段间的识别、重建完成外蛋白子(DnaEext-N和DnaEext-C )的剪接，最终形成完整的DanEext蛋白。DnaE'内含肽同样存在于另外些蓝藻中。DnaE intein的剪接特性应用于蛋白环化、蛋白纯化、蛋白片段同位素标记等，特别是应用于蛋白间的相互作用。将2个具有相互作用蛋白分别融合进DnaE intein的2个剪接片段，再直接与报告蛋白(如可发光4企测的荧光素酶、增强型绿色荧光蛋白等)的C端和N端相连。两个蛋白相互作用导致内含肽相互靠近进而折叠显示出6剪接活性,使两个分别在不同载体表达的无活性报告蛋白片段恢复完整的蛋白活性而发光，通过光检测而定量定性蛋白间相互作用。已报道用此方法来监测线粒体释放蛋白、核定位蛋白等。
技术实现思路
本专利技术应用细菌DnaE内含肽的自我剪切功能以及HIV病毒包膜蛋白Env与人类CD4蛋白和CCR5或CXCR4趋化因子蛋白间相互作用可以诱导细胞融合的特点，提供了 一种可用于CCR5或CXCR4趋化因子介导的细胞融合检测模型和拮抗HIV侵染细胞的药物筛选模型。本专利技术采用的技术方案是一种HIV侵染细胞的筛选系统，包括趋化因子受体筛选细胞系和HIV包膜蛋白Env筛选细胞系，所述筛选系统由如下方法构建(l)将DnaE内含肽基因(任意克隆的具有蛋白拼接功能的DnaE内含肽都适用)的C端与报告基因的C端拼接(^^e-Oe/ toW-C),插入质粒1中获得融合表达载体l;将DnaE内含肽基因的N端与报告基因的N端拼接(wptoW-N-d加e -N),插入质粒1中获得融合表达载体2; (2)将人CD4蛋白基因插入质粒2，获得重组表达载体3;将人趋化因子CCR5基因ccr5或CXCR4基因cxcW插入质粒1,获得重组表达载体4; ( 3 )将fflV-l不同的病毒抹Env基因HXB2-em;或SF162-gpM0基因插入质粒3,获得重组表达载体5; (4)将载体1或载体2中的一个，与载体3和4共转染至HEK293细胞或CHO细胞，获得稳定表达的趋化因子受体筛选细胞系；(5)将载体1或载体2中的另一个，与载体5共转染至CHO细胞或HEK293细胞(步骤(4 )和步骤(5 ) —般使用不同的细胞，以防止使用相同细胞引起自身融合造成筛选拮抗剂时出现假阳性。但是如果同时做好对照的话，也是可行的(等于增加了一个步骤))，获得稳定表达的HIV包膜蛋白Env筛选细胞系；所述质粒l、质粒2、质粒3为常规的在哺乳动物细胞内高效表达蛋白的载体，质粒1、质粒2可选用pcDNA3.1(Invitrogen公司产品)，pTARGET ( Promega公司产品)等，二种载体可以相同也可以不同，质粒3可选用pSV7d或pCAGGS;所述才艮告基因为常规用于检测的有活性的酶基因或可发光的蛋白基因，包括各种发光蛋白(例如GFP, YFP, CFP, BFP, RFP等)及其突变体，还包括7Jc母发光蛋白或克林霉素，以及各种荧光素酶、P-半乳糖苷酶、酪氨酸酶和其它许多种酶类等。把报告基因一分为二，即报告基因N端和报告基因C端，这二部分均失去酶的活性或焚光，只有经内含肽(intern)把^艮告蛋白N端和报告蛋白C端重新拼接成完整的蛋白，才恢复原有的酶活性或荧光。趋化因子受体筛选细胞系表达^7ae-C-^ptoW-C的重组载体时，HIV包膜蛋白Env筛选细胞系选择含-N- -N的重组载体；反之亦然。具体的，所述筛选系统由如下方法构建(1 )将DnaE内含肽基因(核苦酸序列见SEQ ID NO. 1,氨基S1^列见SEQ ID NO.2 )的C端与报告基因的C端拼接，插入质粒pcDNA3.1中获得融合表达载体1;将DnaE内含肽基因的N端与报告基因的N端拼接，插M粒pcDNA3.1中获得融合表达载体2; (2)将人CD4基因(核苷^列见SEQIDNO.15,氨基酸序列见SEQ ID N0.16)插入质粒pFLAG-CMVTM-3，获得重组表达载体3;将人趋化因子CCR5 (核苷^列见SEQIDNO.U，氨基^列见SEQ ID NO.12 )或CXCR4 (核香酉L^列见SEQ ID N0.13,氨基酉^>列见SEQID'N0.14)基因插入质粒pcDNA3.1,获得重组表达载体4; (3)取本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种ＨＩＶ侵染细胞的筛选系统，包括趋化因子受体筛选细胞系和ＨＩＶ包膜蛋白Ｅｎｖ筛选细胞系，所述筛选系统由如下方法构建：（１）将ＤｎａＥ内含肽基因的Ｃ端与报告基因的Ｃ端拼接，插入质粒１中获得融合表达载体１；将ＤｎａＥ内含肽基因的Ｎ端与报告基因的Ｎ端拼接，插入质粒１中获得融合表达载体２；（２）将人ＣＤ４蛋白基因插入质粒２，获得重组表达载体３；将人趋化因子ＣＣＲ５基因或ＣＸＣＲ４基因插入质粒１，获得重组表达载体４；（３）将ＨＩＶ－１病毒株Ｅｎｖ基因ＨＸＢ２－ｅｎｖ或ＳＦ１６２－ｇｐ１６０基因插入质粒３，获得重组表达载体５；（４）将载体１或载体２中的一个，与载体３和载体４共转染至ＨＥＫ２９３细胞或ＣＨＯ细胞，获得稳定表达的趋化因子受体筛选细胞系；（５）将载体１或载体２中的另一个，与载体５共转染至ＣＨＯ细胞或ＨＥＫ２９３细胞，获得稳定表达的ＨＩＶ包膜蛋白Ｅｎｖ筛选细胞系；所述报告基因为用于检测的有活性的酶基因或可发光的蛋白基因，所述的报告基因的Ｃ端与报告基因的Ｎ端拼接即为报告基因，所述质粒１、质粒２、质粒３为在哺乳动物细胞内高效表达蛋白的载体。

【技术特征摘要】
1.一种HIV侵染细胞的筛选系统，包括趋化因子受体筛选细胞系和HIV包膜蛋白Env筛选细胞系，所述筛选系统由如下方法构建(1)将DnaE内含肽基因的C端与报告基因的C端拼接，插入质粒1中获得融合表达载体1；将DnaE内含肽基因的N端与报告基因的N端拼接，插入质粒1中获得融合表达载体2；(2)将人CD4蛋白基因插入质粒2，获得重组表达载体3；将人趋化因子CCR5基因或CXCR4基因插入质粒1，获得重组表达载体4；(3)将HIV-1病毒株Env基因HXB2-env或SF162-gp160基因插入质粒3，获得重组表达载体5；(4)将载体1或载体2中的一个，与载体3和载体4共转染至HEK293细胞或CHO细胞，获得稳定表达的趋化因子受体筛选细胞系；(5)将载体1或载体2中的另一个，与载体5共转染至CHO细胞或HEK293细胞，获得稳定表达的HIV包膜蛋白Env筛选细胞系；所述报告基因为用于检测的有活性的酶基因或可发光的蛋白基因，所述的报告基因的C端与报告基因的N端拼接即为报告基因，所述质粒1、质粒2、质粒3为在哺乳动物细胞内高效表达蛋白的载体。2. 如权利要求1所述的筛选系统，其特征在于所述筛选系统由如下方法 构建(1)将DnaE内含肽基因的C端与才艮告蛋白基因的C端拼接， 插入质粒pcDNA3.1中获得融合表达载体1;将DnaE内含肽基因的N 端与报告蛋白基因的N端拼接，插入质粒pcDNA3.1中获得融合表达 载体2; (2 )将人CD4基因插入质粒pFLAG-CMVTM-3,获得重组表达 载体3;将人趋化因子CCR5或CXCR4基因插入质粒pcDNA3.1，获得重组表达载体4;(3 )取fflV包膜蛋白基因HXB2-env插入质粒pSV7d 或SF162-gp160基因插入质粒pCAGGS,获得重组表达载体5; (4 )将 载体1或载体2中的一个，与载体3和4共转染至HEK293细胞或CHO 细胞，获得稳定表达的趋化因子受体筛选细胞系；(5)将载体1或载 体2中的另...

【专利技术属性】
技术研发人员：周耐明，陈林洁，张亚萍，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：86[中国|杭州]