苏云金芽胞杆菌FH21、杀虫基因，表达蛋白及其应用制造技术

本发明专利技术涉及“苏云金芽胞杆菌FH21、杀虫基因，表达蛋白及其应用”，属于生物防治技术领域。一株苏云金芽胞杆菌菌株FH21，其保藏编号为CGMCC No.10090，从菌株中分离得到四种杀虫蛋白，具有如SEQ ID NO 2、4、6、8所示的氨基酸序列，及编码该杀虫蛋白的基因，优选其的核苷酸序列如SEQ ID NO1、3、5、7所示。菌株和上述基因对鳞翅目害虫具有高毒力，以应用于转化微生物和植物，使之表现出对相关害虫的毒性，并克服、延缓害虫对工程菌和转基因植物的抗药性产生。

【技术实现步骤摘要】
苏云金芽胞杆菌FH21、杀虫基因，表达蛋白及其应用
本专利技术涉及生物防治
，特别是进一步，本专利技术涉及对鳞翅目农业害虫具有高毒力的Bt杀虫基因及由该基因所编码的蛋白质。
技术介绍
苏云金芽胞杆菌(Bacillusthuringiensis，简称Bt)是一种分布广泛的革兰氏阳性细菌，是一种对害虫毒力强且对天敌无毒性的昆虫病原微生物，对高等动物和人无毒性。它是目前研究最为深入、使用最为广泛的微生物杀虫剂，对16个目3000多种害虫有活性。Bt在芽胞形成期可形成杀虫晶体蛋白(InsecticidalCrystalProteins，ICPs)，也称δ-内毒素(delta-endotoxin)，它的形状、结构和大小均与其毒力有着密切关系[Schnepf.E,Crickmore.N,VanRie.J.,Lereclus.D,Baum.J,Feitelson.J,Zeigler.D.R.,Dean.D.H.Bacillusthuringiensisanditspesticidalcrystalproteins.Microbiol.Mol.Biol.Rev,1998,62(3):775-806.]。自1981年Schnepf等克隆了Bt的第一个ICPs基因，并于1985年发表了它的DNA碱基序列及其编码蛋白的氨基酸序列起，目前(2014年4月)共776个，其中cry基因738个，cry模式基因289个；cyt基因38个，cyt模式基因11个。当今，采用喷施化学农药防治手段固然可以减轻害虫对农作物的为害,但化学农药造成环境污染,长期以来,大量喷施化学杀虫剂,不仅会增强害虫的抗药性,使益虫及其它生态区系遭受破坏,而且严重污染环境,提高生产成本,破坏生态平衡。苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白因其杀虫效果好、安全、高效等优点而被广泛的应用于虫害防治。苏云金芽胞杆菌除了直接作为生物农药以外，1996年全世界第一例转基因抗虫植物在美国获准应用，它使用的基因来自Btcry1Ac。在接下来的几年里，转cry1Ab基因的抗虫玉米，转cry3Aa基因的抗虫土豆等相距问世。在中国，自1998年开始正式推广含有cry1Ac/cry1Ab基因的抗虫棉以来，已经被普遍种植。在转基因作物商业化的第一个12年(1996-2007)中，由于能得到持续稳定的收益，农民种植转基因作物量逐年增加。2013年，27个国家的1800万农民种植了1.752亿公顷(4.33亿英亩)的转基因作物，比2012年持续增长了3％，即500万公顷(1200万英亩)。1800万农民从转基因作物中获益，其中90％为资源匮乏的小农户。前五个种植转基因作物的发展中国家是亚洲的中国和印度、拉丁美洲的巴西和阿根廷以及非洲的南非，共种植8270万公顷的转基因作物，占全球转基因作物种植面积的47％，并且这五个国家的人口约占全球70亿人口的41％。中国750万资源匮乏的小农户种植了420万公顷的Bt棉花，采用率为90％，平均每户农民种植0.5公顷的Bt棉花。转基因作物商业化给工业化国家和发展中国家的农民都带来了经济和环境效益。苏云金芽胞杆菌及其基因发掘已成为可持续发展农业中重要课题。由于目前商品化的转基因抗虫作物的抗虫基因种类比较单一，如此大面积推广种植存在害虫避难所减少与害虫抗药性上升的风险。因此需要不断分离高毒力的或者新的基因组合来避免害虫抗药性上升的风险。因此，筛选分离克隆新的、高毒力的Bt杀虫基因，可以丰富杀虫基因资源，为转基因作物与工程菌株提供新的基因来源，提高Bt转基因产品的抗虫效果，并且可以降低害虫对Bt毒蛋白的抗性风险，避免新的生态灾难降临，具有重要的经济、社会和生态效益。
技术实现思路
本专利技术提供一种对鳞翅目害虫高毒力的苏云金芽胞杆菌菌株FH21，及其杀虫新基因cry1Bb，cry1Da，cry1Id，cry1Ja和其晶体杀虫蛋白，以应用于转化微生物和植物，使之表现出对相关害虫的毒性，并克服、延缓害虫对工程菌和转基因植物的抗药性产生。苏云金芽胞杆菌菌株FH21，其保藏编号为：CGMCCNo.10090。苏云金芽胞杆菌菌株FH21在杀灭鳞翅目农业害虫中的应用。杀虫蛋白Cry1Bb3，Cry1Da4，Cry1Id3或Cry1Ja3，其氨基酸序列如SEQIDNO2、SEQIDNO4、SEQIDNO6、SEQIDNO8所示。基因cry1Bb3，cry1Da4，cry1Id3或cry1Ja3，编码杀虫蛋白Cry1Bb3，Cry1Da4，Cry1Id3，Cry1Ja3。所述基因序列如SEQIDNO1、SEQIDNO3、SEQIDNO5、SEQIDNO7所示。一种表达载体，其特征是含有cry1Bb3，cry1Da4，cry1Id3或cry1Ja3基因。所述表达载体为pEB-cry1Bb3，pEB-cry1Da4，pEB-cry1Id3或pEB-cry1Ja3，其骨架载体为pEB，其结构如图6所示。一种微生物转化体，其特征是含有cry1Bb3,cry1Da4,cry1Id3或cry1Ja3基因。基因cry1Bb3，cry1Da4，cry1Id3，cry1Ja3在杀灭鳞翅目农业害虫中的应用。所述应用是将cry1Bb3,cry1Da4,cry1Id3或cry1Ja3基因表达的蛋白作为生物杀虫剂的有效成分。本专利技术人从黑龙江省凤凰山附近土壤中分离得到一株苏云金芽胞杆菌菌株FH21，其保藏编号为CGMCCNo.10090，该菌株生物学特性为在生长周期中可以产生芽胞，并且同时产生有毒杀鞘翅目害虫作用的伴胞晶体，其对鳞翅目农业害虫具有很强的杀灭能力；从该菌株中得到4个基因的阳性克隆，即pEB-cry1Bb,pEB-cry1Da,pEB-cry1Id,pEB-cry1Ja(见图6)，对其进行测序分析，在NCBI网站上应用BLAST并应用DNAMAN等生物软件进行分析，分析结果证明所克隆的基因是cry1Bb基因，该基因编码框是由3609个碱基组成，编码氨基酸数量为1203个，经过比对发现该基因所编码的蛋白与Cry1Bb2的氨基酸同源性是最高的，它们的一致性达到了99％，所以该基因应属于第四等级的新基因，提交GenBank获得登录号为KJ619659，经国际δ-内毒素命名委员会正式命名为Cry1Bb3。该蛋白比对结果如下：>Cry1Bb:Length＝1203Score＝2500bits(6480),Expect＝0.0Identities＝1202/1203(99％),Positives＝1202/1203(99％),Gaps＝0/1203(0％)在NCBI网站上应用BLAST并应用DNAMAN等生物软件进行分析[[84]，分析结果证明所克隆的基因是cry1Da基因，该基因编码框是由3492个碱基组成，编码氨基酸数量为1164个，经过比对发现该基因所编码的蛋白与Cry1Da2的氨基酸同源性是最高的，它们的一致性达到了99％，所以该基因应属于第四等级的新基因，提交GenBank获得登录号为KJ619660，经国际δ-内毒素命名委员会正式命名为Cry1Da4。该蛋白比对结果如下：>Cry1Da:Length＝1164Score＝2409bits(6242),Expect＝0.0本文档来自技高网...

【技术保护点】
苏云金芽胞杆菌菌株FH21，其保藏编号为：CGMCC No.10090。

【技术特征摘要】
1.苏云金芽胞杆菌菌株FH21，其保藏编号为：CGMCCNo.10090。2.权利要求1所述的苏...

【专利技术属性】
技术研发人员：高继国，李海涛，刘荣梅，张杰，
申请(专利权)人：东北农业大学，
类型：发明
国别省市：黑龙江;23