一种治疗丙型肝炎病毒药物的制备方法和用途技术

本发明专利技术公开了一种全人源抗HCV的单克隆中和抗体。验证表明该抗体能够与HCV特异性结合，因此本发明专利技术的抗体可用于制备诊断HCV的产品。另外，本发明专利技术的抗体有较好的HCV中和活性，进而能够阻止HCV感染导致相关疾病，并且本发明专利技术的抗体是全人源抗体，其具有较鼠源、嵌合及人源化抗体更低的免疫原性，因此本发明专利技术的抗体可用于制备治疗或预防HCV相关疾病的药物。

【技术实现步骤摘要】
一种治疗丙型肝炎病毒药物的制备方法和用途
本专利技术属于细胞免疫学、分子生物学领域，涉及一种全人源的单克隆抗体药物，尤其涉及一种全人源抗丙型肝炎病毒的单克隆中和抗体药物。另外，本专利技术还涉及该中和抗体药物的制备方法和用途。
技术介绍
丙型肝炎由丙型肝炎病毒(HCV)感染所致，主要由血液/体液传播。据世界卫生组织估计，全球有1.7亿人感染HCV。在我国健康人群抗HCV阳性率为0.7％～3.1％，约3800万人。由于病毒生物学特点和宿主免疫功能等多方面因素，机体免疫往往难以有效清除病毒，致使约50％～80％HCV感染者发展为慢性肝炎，其中20％～30％将发展成肝硬化。肝硬化患者中每年有1％～4％发展成为肝细胞癌症。目前，针对丙型肝炎的治疗药物有干扰素、核苷类似物、多肽类药物及中草药、以及小分子药物等，每种药物虽具有不同程度的疗效，但均未能彻底根除HCV。随着研究的发展，治疗性抗体成为了丙型肝炎治疗的新方向。治疗性抗体是近年来增长势头较强劲的生药产品，至目前为止，已有约30种单克隆抗体获批上市用于多种疾病的诊断和治疗。在各种急慢性病毒性肝炎的治疗及研究中，单克隆抗体的应用尤为广泛且具有不可替代的作用。就发展进程而言，单克隆抗体可分为鼠源性单抗、鼠源抗体人源化以及全人源性单抗三种阶段类型的抗体。鼠源性单克隆抗虽然具有获取方法较为成熟，且抗体具有高亲和力等优势，但是伴随着该内抗体在体内半衰期短、人抗鼠排斥反应(humananti-murine-antibodyresponse，HAMA)强烈、抗体依赖的细胞毒(antibody-dependentcellcytotoxicity，ADCC)和补体依赖的细胞毒(complement-dependentcytotoxicity，CDC)作用激发强度不合适弊端的出现，从而限制此类抗体的有效应用。鼠源抗体人源化即嵌合抗体是将鼠抗体的部分序列置换成人的序列，该方法在一定程度上降低了HAMA，但亲和力也随之降低。为了获得更安全、高效的单克隆抗体，研究人员尝试了多种获得全人源性的单克隆抗体方法，较为常见的有，利用基因工程小鼠制备单克隆抗体，噬菌体抗体库技术以及单个B淋巴细胞抗体制备技术等。本专利技术所涉及的单个B淋巴细胞抗体制备技术，是将单细胞分离鉴定技术结合多种PCR技术形成的一种单克隆抗体的体外表达系统，即从人B淋巴细胞中直接获取全人源的单克隆抗体的方法。产生的抗体具有全人源性、高度抗原特异性、亲和性等优势，在治疗肿瘤、感染性疾病、自身免疫性疾病和器官移植等方面显出了独特的优势和良好的应用前景。因此，非常有必要选择先进高效的单克隆抗体制备技术制备抗体治疗和预防HCV感染。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种与丙型肝炎病毒(HCV)的结合分子，该结合分子对丙型肝炎病毒具有有效的中和作用。为了实现上述目的，本专利技术采用了如下技术方案：本专利技术提供了一种分离的结合分子，所述结合分子包括：(1)SEQIDNO:2所示的重链CDR1、SEQIDNO:3所示的重链CDR2、SEQIDNO:4所示的重链CDR3；和/或(2)SEQIDNO:6所示的轻链CDR1、SEQIDNO:7所示的轻链CDR2、SEQIDNO:8所示的轻链CDR3。作为本专利技术的一个方面，本专利技术的结合分子包括：(1)重链可变区，所述重链可变区具有SEQIDNO:1所示的氨基酸序列；和/或(2)轻链可变区，所述轻链可变区具有SEQIDNO:5所示的氨基酸序列。本专利技术的“结合分子”是指抗体分子及具有免疫学活性的片段，即含有免疫特异性结合抗原的抗原结合位点的分子。本专利技术的抗体分子可以是任何类型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA)、任何类别(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、hIgA2)或亚类的抗体分子。抗体分子的免疫学活性部分包括但不限于Fab、Fab’和F(ab’)2、Fd、单链Fv(scFv)、单链抗体、二硫键连接的Fv(sdFv)和包括VL或VH结构域的单域抗体。包括单链抗体在内的结合抗原的抗体片段可以包括单独的可变区或与以下的全部或一部分组合的可变区：绞链区、CH1、CH2和CH3结构域。本专利技术也包括抗原结合片段，其包括可变区与绞链区、CH1、CH2和CH3结构域的任一组合。本专利技术的结合分子还包括与多肽重组融合的或化学缀合的(包括共价和非共价缀合的)结合分子。多肽重组融合的例子包括将本专利技术的结合分子与标记物序列融合，标记物序列包括但不限于HA标签、6xHis标签、c-Myc标签、flag标签。化学缀合的例子包括将本专利技术的结合分子与可检测物质缀合。通过将抗体偶联到可检测物质可以促进检测。可检测物质的实例包括各种酶、辅基、荧光材料、发光材料、生物发光材料、放射性材料、利用各种正电子发射断层扫描的正电子发射金属、以及非放射性的顺磁性金属离子。利用本领域已知的技术，可检测物质可以直接地与抗体(或其片段)偶联或缀合，或经中间物(例如本领域已知的接头)间接地偶联或缀合。参见例如关于金属离子的美国专利No.4,741,900，其中所述金属离子可以与抗体缀合，用作本专利技术的诊断剂。合适的酶的实例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、或乙酰胆碱酯酶；合适的辅基复合物的实例包括链霉抗生物素蛋白/生物素和抗生物素蛋白/生物素；合适的荧光材料的实例包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、dichlorotriazinylamine荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光材料的实例包括鲁米诺；生物发光材料的实例包括萤光素酶、萤光素、和水母发光蛋白；合适的放射性材料的实例包括125I、131I、111In或99Tc。本专利技术的结合分子还包括前面所述的结合分子的功能变体。如果变体能与亲代结合分子竞争特异性结合丙型肝炎病毒或其蛋白片段，则认为该变体分子是本专利技术结合分子的功能变体。换句话说，所述功能变体仍能结合丙型肝炎病毒或其蛋白片段。所述功能变体可以具有保守序列修饰，包括氨基酸取代、添加和缺失。这些修饰可以通过本领域己知的标准技术导入，例如定向诱变和随机PCR介导的诱变，并且可包含天然以及非天然氨基酸。此外，功能变体可包含氨基酸序列在氨基末端或者羧基末端或者这两端的截短体。本专利技术的功能变体与亲代结合分子相比可具有相同或不同的、更高或更低的结合亲和性，但是仍能结合丙型肝炎病毒或其片段。本专利技术的功能变体对于丙型肝炎病毒具有中和活性。所述中和活性与亲代结合分子相比可以相同或者更高或更低。此后，当使用术语“结合分子”时，其也涵盖所述结合分子的功能变体。作为本专利技术的另一方面，本专利技术还提供了前面所述的结合分子的多核苷酸。本专利技术还包括在严格或较低严格的条件下能与编码本专利技术的结合分子的多核苷酸杂交的多核苷酸。本领域技术人员将意识到这些多核苷酸的功能变体也是本专利技术的一部分。功能变体是这样的核甘酸序列，通过使用标准遗传密码可以将其直接翻译以提供与从亲代核酸分子中翻译的序列相同的氨基酸序列。可以利用本领域任一已知的方法得到多核苷酸序列，并确定出多核苷酸的核苷酸序列。例如，如果已知抗体的核苷酸序列，就可以从化学合成的寡核苷酸装配出编码所述抗体的多核苷酸。或者，可以从来自合适来源的核酸中产生编码抗体的多核苷酸。如果无法得到含有编码特定抗体的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种分离的结合分子，其特征在于，所述结合分子包括：(1)SEQ ID NO:2所示的重链CDR1、SEQ ID NO:3所示的重链CDR2、SEQ ID NO:4所示的重链CDR3；和/或(2)SEQ ID NO:6所示的轻链CDR1、SEQ ID NO:7所示的轻链CDR2、SEQ ID NO:8所示的轻链CDR3。

【技术特征摘要】
1.一种分离的结合分子，其特征在于，所述结合分子包括：(1)SEQIDNO:2所示的重链CDR1、SEQIDNO:3所示的重链CDR2、SEQIDNO:4所示的重链CDR3；和/或(2)SEQIDNO:6所示的轻链CDR1、SEQIDNO:7所示的轻链CDR2、SEQIDNO:8所示的轻链CDR3。2.根据权利要求1所述的结合分子，其特征在于，所述结合分子包括：(1)重链可变区，所述重链可变区具有SEQIDNO:1所示的氨基酸序列；和/或(2)轻链可变区，所述轻链可变区具有SEQIDNO:5所示的氨基酸序列。3.根据权利要求1所述的结合分子，其特征在于，所述结合分子是抗体分子或其免疫学活性片段。4.编码权利要求1-3中任一项所述的结合分子的多核苷酸。5.一种包括权利要求4所述的多核苷酸的重组表达载体。6.一种宿主细胞，其特...

【专利技术属性】
技术研发人员：廖化新，张远旭，袁晓辉，王月明，昝利鹏，吴昌文，李楠，
申请(专利权)人：广州泰诺迪生物科技有限公司，珠海泰诺麦博生物技术有限公司，暨南大学，
类型：发明
国别省市：广东,44