人偏肺病毒(HMPV)的M抗原的特异性单克隆抗体及其在诊断方法中的用途技术

本发明专利技术涉及鼠类单克隆抗体，其相应于由被命名为3G8/C11和7G4/A12的杂交瘤细胞系所分泌的单克隆抗体，并且针对hMPV的M抗原进行反应。这些抗体相互之间不竞争与所述抗原的结合位点，也不对于与所述抗原的同时结合施加障碍。所述单克隆抗体可以用于hMPV感染的检测、诊断和/或测定的检定试验。

Monoclonal antibodies specific to M antigens of human pulmonary virus (HMPV) and their use in diagnostic methods

The present invention relates to murine monoclonal antibodies, corresponding to monoclonal antibodies secreted by hybridoma cell lines designated as 3G8/C11 and 7G4/A12, and responsive to the M antigen of hMPV. These antibodies do not compete with each other and bind sites of the antigen, nor do they impose barriers to simultaneous binding with the antigen. The monoclonal antibodies can be used for the detection, diagnosis and / or assay of hMPV infection.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】人偏肺病毒(HMPV)的M抗原的特异性单克隆抗体及其在诊断方法中的用途专利
本专利技术涉及识别呼吸道病毒人偏肺病毒(hMPV)的M蛋白的单克隆抗体或其片段，其可用于开发在人中的hMPV感染的诊断方法。专利技术背景人偏肺病毒(此后，hMPV)是与上和下呼吸道的急性呼吸系统疾病相关的代表性住院百分比和发病率的病因学因子，特别是在婴儿、老年人和无免疫应答的个体中。由该病毒引起的感染与宽范围的病理学状况相关，其中细支气管炎和肺炎属于具有较大社会经济影响的情形。另外，已经将hMPV感染与胃肠炎和角膜结膜炎相关联。例如，Calvo等人(2008)在3年的时间段中证明，由呼吸道病毒(呼吸道合胞病毒(RSV)、腺病毒(ADV)和hMPV)引起的急性呼吸道感染的累积发病率对于64.5％的小于2岁的儿童的住院负有责任，其中对于所述病毒中的每一种而言发病率分别为35.4％、19.3％和9.8％。hMPV与其他具有高发病率的呼吸道病毒所共有的一个令人感兴趣的特征为在整个幼年期间产生反复感染，这是一种可能与在生命的最初几个月期间在建立针对初次感染的保护性免疫应答方面的失败相关的现象。迄今为止，还没有关于hMPV感染引起的特别的经济影响的研究，然而，由hMPV造成的住院发生率据估计为由人呼吸道合胞病毒(hRSV)造成的住院发生率的1/3。在发达国家中进行的研究估计，hRSV感染的个体花费为大约3,000欧元($1,860,000智利比索)，其中具有直至8,400欧元($5,200,000智利比索)的上限。考虑到需要住院的病理学过程具有相似的特征，暗示了关于个体住院的花费是近似的。虽然病毒hMPV和hRSV分别被分组在偏肺病毒属(Metapneumovirus)和肺病毒属(Pneumovirus)中，但病毒hMPV被归类为副粘病毒科(Paramyxoviridae)的肺病毒亚科(Pneumovirinae)，这是与hRSV被归类为的相同的分类。hMPV的基因组由负义的不分节段的单链核糖核酸(ssRNA)组成，因此病毒蛋白质以3’至5’的方向(关于其序列)按下列形式进行安排：N、P、M、F、M2(ORF1和ORF2)、SH、G和L。这些蛋白质中的五个负责遗传物质的包装和确定病毒颗粒的特有结构，它们分别相应于核衣壳蛋白N和基质蛋白M，以及跨膜糖蛋白F、G和SH。其他四个蛋白质M2-1、M2-2、P和L参与病毒的复制和转录。存在两种亚型的hMPV，它们基于主要在F和G蛋白中的序列差异而被划分为A和B(关于两个抗原组)。虽然这些蛋白质具有一定程度的差异，但是相对于由病毒基因组所编码的其他蛋白质而言，存在高度的同一性。目前，为了检测hMPV，使用了三种技术：RT-PCR，其直接从鼻咽拭子的样品扩增F和N基因的区段；呼吸道病毒鉴定组盒(respiratorypanel)(同时鉴定各种不同类型的呼吸道病毒的直接免疫荧光方法，其常规地在临床实验室中使用)；和在LLC-MK2细胞中的体外培养，以便观察致细胞病变效应。这些技术具有不大于70％的灵敏度，并且结果在两者之间是不一致的。低灵敏度和这些技术之间的不一致所产生的问题之一涉及下述情形：对于呼吸道病毒鉴定组盒来说阴性的呼吸道感染通常用抗生素进行了治疗，以避免可能的细菌超感染。由此，目前由可得的技术所交出的假阴性未接受适当的治疗并且使患者暴露于不必要的抗生素治疗，这还在所述患者中增加了产生抗生素抗性的可能性。因此，极其重要的是拥有对于hMPV的有效且快速的诊断测试。面对这样的问题，本专利技术的单克隆抗体看起来是对于满足所述需求来说必需的备选方案，因为其使得能够特异性地识别在被hMPV感染的患者的样品中的病毒抗原。由此，本专利技术包括产品，例如单克隆抗体，以及使用它们来在被hMPV感染的患者中进行快速、有效且准确的检测和诊断的备选方法，所述检测和诊断具有在临床样品中100％的特异性并且能够通过ELISA而检测出等价于1.5ng特定抗原的浓度。这允许临床医生决定能够先于疾病演变的提早和适当的治疗。专利技术简述本专利技术涉及两种针对人偏肺病毒(hMPV)的单克隆抗体。具体而言，本专利技术牵涉两种鼠类单克隆抗体，其相应于由被命名为3G8/C11和7G4/A12的杂交瘤细胞系所分泌的单克隆抗体，并且针对hMPV的M抗原进行反应。这些抗体相互之间不竞争与所述抗原的结合位点，也不对于与所述抗原的同时结合施加障碍。所述单克隆抗体可以用于hMPV感染的检测、诊断和/或测定的检定试验。可以同时使用这些抗体以增加在其中存在少量抗原的临床样品中的检测灵敏度。例如，如在图6中所显示的，来自于杂交瘤3G8/C11的抗体能够在临床样品中有效地捕获hMPV的M蛋白。随后，用由杂交瘤7G4/A12所产生的抗体(其缀合有对生色底物起作用的酶)来检测这些被捕获且经固定的蛋白质。该特性使得能够将具有不同标记的这两种抗体相组合以用于在其中存在少量抗原的样品中检测同一种抗原。本专利技术提供了离体或体外诊断和检测hMPV的病毒抗原M的方法，在所述方法中在检定试验例如ELISA、荧光显微镜检术和免疫印迹中使用由杂交瘤3G8/C11和7G4/A12所产生和分泌的单克隆抗体。待分析的样品尤其可以为：在体外被hMPV感染的细胞、鼻分泌物、鼻灌洗物、咽分泌物和/或支气管灌洗物或分泌物。本专利技术提供了在生物学样品和细胞培养物中检测hMPV的方法，其中使用由上面提及的杂交瘤细胞系所产生和/或分泌的单克隆抗体，所述单克隆抗体偶联在任何类型的固体支持物(例如硝酸纤维素、尼龙膜、磁珠、荧光珠或其他支持物)上；或者偶联至任何其他分子，例如酶、蛋白质、荧光团、放射性同位素或任何其他化学化合物。本专利技术可以在关于hMPV的检测试剂盒中进行使用，所述试剂盒包含由所提及的杂交瘤所产生的抗体。此外，本专利技术在其范围内包括掺入任何类型的以化学方式结合的分子或底物，例如标记物、荧光团、生物素、放射性同位素、金属、酶和/或任何与由杂交瘤3G8/C11和7G4/A12所分泌的单克隆抗体相偶联的化学元素，其中所述以化学方式结合的分子或底物使得能够对所述抗体进行可视化或检测。由此，本专利技术还提供了抗体，其特异性地识别与不同于所述抗体的分子或底物或标记物相偶联的M蛋白，作为在生物学样品中进行检测、分析和/或诊断的方法的一部分。附图描述图1：借助于间接ELISA检定试验，用由杂交瘤3G8/C11和7G4/A12所产生的单克隆抗体来检测hMPVM蛋白。用50ng的经纯化的重组hMPVM蛋白或用1×106pfu的hMPV活化平板。作为阴性对照，用1×106pfu的呼吸道合胞病毒(RSV)或用50ng的蛋白质BSA活化其他孔；还包括没有抗原、具有一抗、具有缀合有HRP的抗小鼠IgG的对照孔(没有活化)，和既没有抗原也没有一抗、仅具有抗小鼠IgG抗体的孔(HRP)。随后，将所述孔与以170ng的量的来自于杂交瘤3G8/C11的抗-M抗体(A)、以170ng的量的来自于杂交瘤7G4/A12的抗体(B)和以680ng的量进行使用的商业抗体“抗人偏肺病毒75.1抗体”(克隆1B7，目录号MAB8510(EMDMillipore))(C)一起进行温育。在该图中所显示的数据表示在450nm处检测到的吸光度，其是通过由存在于抗小鼠I本文档来自技高网...

【技术保护点】
与呼吸道病毒人偏肺病毒(hMPV)的M蛋白相结合的单克隆抗体或其片段，其特征在于，所述单克隆抗体或其片段包含具有与SEQ ID No:1或SEQ ID No:5具有至少90％、95％或99％同一性的序列的重链可变区，和具有与SEQ ID No:2或SEQ ID No:6具有至少90％、95％或99％同一性的序列的轻链可变区。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.12.11 CL 2014-33731.与呼吸道病毒人偏肺病毒(hMPV)的M蛋白相结合的单克隆抗体或其片段，其特征在于，所述单克隆抗体或其片段包含具有与SEQIDNo:1或SEQIDNo:5具有至少90％、95％或99％同一性的序列的重链可变区，和具有与SEQIDNo:2或SEQIDNo:6具有至少90％、95％或99％同一性的序列的轻链可变区。2.根据权利要求1的与呼吸道病毒人偏肺病毒(hMPV)的M蛋白相结合的单克隆抗体或其片段，其特征在于，所述抗体或片段还结合有从由荧光团、生物素、放射性同位素、金属和酶组成的组中选择的标记物。3.编码根据权利要求1或2的与呼吸道病毒人偏肺病毒(hMPV)的M蛋白相结合的单克隆抗体或其片段的核苷酸序列的套组，其特征在于，所述核苷酸序列的套组包括与SEQIDNo:3或SEQIDNo:7及其互补的反面序列具有至少80％、85％、90％、95％和99％同一性的核苷酸序列，其编码所述抗体的重链可变区，和包括与SEQIDNo:4或SEQIDNo:8及其互补的反面序列具有至少80％、85％、90％、95％和99％同一性的核苷酸序列，其编码所述抗体的轻链可变区。4.在生物学样品中hMPV感染的体外和/或离体诊断方法，其特征在于，所述方法包括使所述生物学样品与根据权利要求1或2的针对hMPV的单克隆抗体或其片段相...

【专利技术属性】
技术研发人员：S·M·布埃纳拉米耶，A·M·卡莱伊斯帕拉，J·E·莫拉阿拉尔孔，
申请(专利权)人：智利天主教教皇大学，
类型：发明
国别省市：智利,CL