对呼吸道合胞体病毒(RSV)的F蛋白具有特异性的人单克隆抗体制造技术

本发明专利技术涉及源自RSV‑感染的人的抗体构建体或其片段，从而该抗体构建体以大于1x10

Human monoclonal antibodies specific for F protein of respiratory syncytial virus (RSV)

The present invention relates to antibodies from RSV infected person constructs or its fragments, and the antibody constructs to more than 1x10

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】对呼吸道合胞体病毒(RSV)的F蛋白具有特异性的人单克隆抗体专利
本专利技术涉及单克隆抗体构建体或抗体片段，其对呼吸道合胞体病毒(RSV)的融合蛋白(F蛋白)具有特异性，编码所述抗体构建体或片段的核酸，和表达所述抗体构建体或片段的细胞系。本专利技术还涉及用于产生所述单克隆抗体构建体或抗体片段的方法，和所述单克隆抗体构建体或抗体片段用于治疗或预防具有常规或突变的形式的F蛋白的RSV的感染的应用。相关领域描述呼吸道合胞体病毒(RSV)是人呼吸道感染的最常见病因之一，并且是婴儿住院治疗的首要原因，以及婴儿死亡的首要病毒因素。每年冬季都有RSV流行病复发。每年的爆发严重性可能会有变化，这归因于两种主要RSV株A组和B组的共同传播。在给定的年度流行过程中，群体中的大部分发展RSV上和/或下呼吸道感染。全部婴儿中有约2/3在其生命第一年中感染RSV。发病率高峰出现在2-8月龄；截至2岁时，有99％的儿童已感染过RSV至少一次，且36％已感染至少两次。这些RSV感染中的大部分导致轻度上呼吸道疾病和感冒样症状。总体上，4-5百万4岁以下的儿童经历RSV感染，且美国有多于120,000儿童每年因该感染而住院治疗。人们努力开发有效疫苗，但长期以来未能成功。甚至在重复疫苗接种之后，人免疫系统也无法产生充分保护性的基于抗体的免疫应答。每年复发的感染甚至常见于免疫功能正常的先前感染过的个体，虽然在具有完整免疫系统的较年长的儿童和成人中少见住院治疗。疫苗接种或重复感染之后的保护性免疫缺失的原因目前未知。目前，几乎没有可用于RSV下呼吸道感染的治疗方案，并且，必须在感染发作时及时开始治疗以抑制病毒有效复制。在1986年，美国食品药品监督管理局(FDA)批准了利巴韦林，其为一种广谱抗病毒剂，用于治疗患有严重RSV疾病的儿童。F蛋白介导病毒膜与靶细胞膜的融合，因此介导病毒基因组进入靶细胞。F蛋白包埋进入感染的细胞膜，介导感染的细胞及其相邻物之间的融合，导致RSV感染特征性的合胞体形成。F蛋白是I型融合蛋白，其由亚稳的融合前构象重排成高度稳定的融合后结构。蛋白质中的该结构变化是膜融合所需的。结合至抗原性位点II/A的抗体干扰该结构变化，由此预防靶细胞感染、感染的细胞与相邻细胞的融合，和合胞体的后续形成。融合机制的抑制防止体外和体内感染，有效地中和病毒。先前的动物实验指示，针对RSV感染的保护主要由中和抗体，尤其是针对RSV颗粒表面上的F蛋白的抗体提供。鼠源性单克隆抗体，例如MED-493(也称为帕利珠单抗或Synagis)被后续开发用于处于RSV感染的风险的人(Boeckh,M等，2001)。帕利珠单抗在1998年通过FDA批准用于高风险患者，并且是目前批准用于人的针对RSV的唯一单克隆抗体。采用对RSVA2株的F蛋白具有特异性的鼠源性中和抗体，构建了中和和融合中涉及的表位的详细拓扑学和操作图。鉴定了三种非重复抗原性位点(A、B和C)和一个桥接位点(AB)。市售可得的抗RSV单克隆抗体，帕利珠单抗，结合至成熟F蛋白胞外结构域的高度保守区域，称为抗原性位点II或位点A(抗原性位点II/A)，据称其涵盖氨基酸262-275。帕利珠单抗的安全性和功效验证了抗原性位点II/A是至关重要且有效的单克隆抗体靶标，用作预防性手段以预防感染。不过，RSV株有一亚集对于帕利珠单抗具有抗性，并且采用帕利珠单抗可选择所述抗性株。第二代抗体，莫维珠单抗，通过处理帕利珠单抗的六个互补决定区(CDR)中的个体氨基酸而产生。这些区域中的氨基酸各自被任何氨基酸取代，并且选择具有优于帕利珠单抗的改善的功效且不改变对于确定表位的特异性的最佳组合。莫维珠单抗比其前体帕利珠单抗有力约十倍，这归因于其对F蛋白的更高亲和性。然而，莫维珠单抗不提供针对具有造成下呼吸道感染的高风险的患者中的RSV感染的保护的显著改善，并且具有出现不希望的副作用的较高风险，尤其是过敏反应。FDA未批准莫维珠单抗用于人。临床结果显示，对现有抗体序列中的少数氨基酸进行处理可能会增加人中严重副作用的风险。已进行改善帕利珠单抗抗体的其它尝试。在授予Spits的RSV特异性结合分子和用于生产它们的手段(RSV-SpecificBindingMoleculesandMeansforProducingThem)(U.S.8,562,996)中，提供了针对RSV的不同表位区域的高亲和性抗体。似乎该抗体针对某些RSV株的IC50可高于帕利珠单抗。在Gurnett的针对呼吸道合胞体病毒F蛋白的人抗体及其使用方法(HumanAntibodiestoRespiratorySyncytialVirusFProteinandMethodsofUseThereof)(U.S.14/207797)中，公开了与帕利珠单抗具有重叠表位区域的抗体，其具有较高亲和性，并且能够中和A亚型和B亚型RSV。然而，尚无参考文献公开任何抗体中和不被帕利珠单抗中和的RSV分离物的能力的任何差异。因此，极其需要靶向广泛RSV株，包括帕利珠单抗抗性株，的新抗体。此外，对于具有较低的人中不利反应的风险的抗体有兴趣。
技术实现思路
本专利技术部分基于以下发现预测：识别RSV的F蛋白的完全人抗体构建体能够中和帕利珠单抗抗性RSV株和帕利珠单抗敏感性RSV株。此外，提供方法和组合物以进一步增强抗体的药物动力学和细胞毒性。显示帕利珠单抗抗性的所有RSV株已显示包含F蛋白上的抗原性区域II/A中特定区域中的氨基酸变化(Zhao,X等，2004)。例如，体外选择的帕利珠单抗抗性RSV株在融合蛋白的位置272处具有突变，从赖氨酸到天冬酰胺、甲硫氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺，或谷氨酸。在突破患者中检测到位置272和275处包含突变的变体。F蛋白抗原性区域II/A作为预防RSV感染(包括下呼吸道道感染)的靶标的合适性已通过帕利珠单抗的功效证实。尽管先前报告抗原性区域II/A中的大多数表位在A亚组病毒中恒定，但位点II/A中的若干表位在B亚组病毒中具有高变性。在测试的所有临床分离物中，F蛋白上的抗原性位点II/A，尤其是帕利珠单抗和莫维珠单抗覆盖的表位(262-275的区域中的氨基酸位置)以1/20的频率经历突变。帕利珠单抗无效于预防这些突变体株所致的下呼吸道道感染。因此，在其中于这些氨基酸位置处发现突变的情况中，相较于帕利珠单抗和莫维珠单抗，靶向相同抗原性区域的抗体可显示改善的功效。因此，急需开发以高于帕利珠单抗的亲和性结合至RSVF蛋白的抗原性区域II/A并且能够预防和/或治疗帕利珠单抗抗性RSV株所致的感染的新单克隆抗体。严重的过敏性反应是基于抗体的预防和/或治疗介入的常见副作用，其高度限制了此类抗体的使用。已在莫维珠单抗的临床测试过程中观察到严重的过敏性副作用。例如，临床测试中观察到频率增加的超敏反应，包括表明过敏性反应的情况。用多个剂量的莫维珠单抗治疗的若干患者发展出抗药物抗体(ADA)并且具有归因于ADA的严重的过敏性反应。帕利珠单抗和莫维珠单抗均为鼠源性且非人来源。莫维珠单抗在CDR处的重新设计的氨基酸结构及其剩余鼠序列是后期临床研究中负面反应的可能原因，而莫维珠单抗最后被认为不具有人类应用安全性。针对病原体例如RSV通过人免疫系统产生的抗体固有地显示与人自身抗原反应的较本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种细胞，其包含编码重链可变区的第一cDNA序列和编码轻链可变区的第二cDNA序列，其中，所述细胞产生包含所述重链可变区和所述轻链可变区的人抗体构建体或抗体片段，其中，所述由第一cDNA序列编码的重链可变区包含：(a)重链互补决定区(CDR)CDR1，其含有氨基酸序列GASINLYD(SEQ ID NO.:8)；(b)重链CDR2，其含有氨基酸序列GYISGST(SEQ ID NO.:9)；和(c)重链CDR3，其含有氨基酸序列ARDVGWGPQYYYGLDV(SEQ ID NO.:10)；并且其中，所述由第二cDNA序列编码的轻链可变区包含：(a)轻链CDR1，其含有氨基酸序列HSVQSTS(SEQ ID NO.:14)；(b)轻链CDR2，其含有氨基酸序列GGS(SEQ ID NO.:15)；和(c)轻链CDR3，其含有氨基酸序列QQSDRSPPIT(SEQ ID NO.:16)，其中，所述抗体构建体或抗体片段以大于1x 10

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.10.29 US 14/527,5451.一种细胞，其包含编码重链可变区的第一cDNA序列和编码轻链可变区的第二cDNA序列，其中，所述细胞产生包含所述重链可变区和所述轻链可变区的人抗体构建体或抗体片段，其中，所述由第一cDNA序列编码的重链可变区包含：(a)重链互补决定区(CDR)CDR1，其含有氨基酸序列GASINLYD(SEQIDNO.:8)；(b)重链CDR2，其含有氨基酸序列GYISGST(SEQIDNO.:9)；和(c)重链CDR3，其含有氨基酸序列ARDVGWGPQYYYGLDV(SEQIDNO.:10)；并且其中，所述由第二cDNA序列编码的轻链可变区包含：(a)轻链CDR1，其含有氨基酸序列HSVQSTS(SEQIDNO.:14)；(b)轻链CDR2，其含有氨基酸序列GGS(SEQIDNO.:15)；和(c)轻链CDR3，其含有氨基酸序列QQSDRSPPIT(SEQIDNO.:16)，其中，所述抗体构建体或抗体片段以大于1x10-9M的亲和性特异性地结合至RSVF蛋白抗原性区域II/A。2.如权利要求1所述的细胞，其中，所述抗体构建体或抗体片段针对至少一种RSV株的中和能力至少2倍大于帕利珠单抗的中和能力。3.如权利要求1所述的细胞，其是植物细胞或哺乳动物细胞。4.如权利要求1所述的细胞，其中，所述重链可变区cDNA序列偶联至编码人免疫球蛋白的恒定区的第三cDNA序列。5.如权利要求4所述的细胞，其中，所述恒定区来自与产生针对RSV的抗体的人不同的来源。6.如权利要求4所述的细胞，其中，所述第三cDNA序列与第一cDNA序列和第二cDNA序列来自不同的患者。7.如权利要求4所述的细胞，其中，所述人免疫球蛋白是IgGl。8.如权利要求1所述的细胞，其中，所述细胞包含一种或多种表达载体，其中，所述一种或多种表达载体包含所述第一cDNA序列或包含所述第二cDNA序列。9.如权利要求1所述的细胞，其中，至少一种表达载体被稳定转染进入所述细胞，并且，其适于提供所述第一cDNA序列或所述第二cDNA序列的表达。10.如权利要求1所述的细胞，其中，至少一种表达载体被瞬时转染进入所述细胞，并且，其适于提供所述第一cDNA序列或所述第二cDNA序列的表达。11.如权利要求1所述的细胞，其中，所述重链可变区cDNA序列包含SEQIDNO.:2的核苷酸序列。12.如权利要求1所述的细胞，其中，所述轻链可变区cDNA序列包含SEQIDNO.:4的核苷酸序列。13.如权利要求1所述的细胞，其中，所述第一cDNA序列包含SEQIDNO.:5、SEQIDNO.:6和/或SEQIDNO.:7的核苷酸序列，并且其中，所述第二cDNA序列包含SEQIDNO.:11、SEQIDNO.:12和/或SEQIDNO.:13的核苷酸序列。14.如权利要求1所述的细胞，其中，所述抗体包含含有SEQIDNO.:1的氨基酸序列的重链可变区。15.如权利要求1所述的细胞，其中，所述抗体构建体或抗体片段包含含有SEQIDNO.:3的氨基酸序列的轻链可变区。16.如权利要求1所述的细胞，其中，所述抗体构建体或抗体片段识别SEQIDNO.:23和/或SEQIDNO.:24的区域中的表位。17.如权利要求1所述的细胞，其中，所述轻链和重链来自由所述患者产生的不同抗体。18.如权利要求1所述的细胞，其中，所述细胞产生抗体片段。19.如权利要求1所述的细胞，其中，所述抗体构建体或抗体片段中和对帕利珠单抗具有抗性的至少一种RSV株。20.如权利要求1所述的细胞，其中，所述抗体或抗体片段包含缺乏岩藻糖和木糖的聚糖；或，其中，所述抗体或抗体片段包含Fc区域，其适于以，比AR201与所述受体结合低至少10倍的亲和性，结合至新生儿上皮细胞受体FcRn。21.一种产生抗体构建体或抗体片段的方法，所...

【专利技术属性】
技术研发人员：H·科齐，S·厄威乐，M·P·鲁道夫，V·L·特鲁翁，
申请(专利权)人：阿瑞迪思医药品股份有限责任公司，
类型：发明
国别省市：美国,US