TIM3人源单链抗体融合基因转化乳酸菌及其应用制造技术

本发明专利技术公开了TIM3人源单链抗体(TIM3Fv)融合基因转化乳酸菌，包括TIM3Fv基因或CTB‑TIM3Fv融合基因转化乳酸菌，是将所述TIM3Fv基因或CTB‑TIM3Fv融合基因插入到乳酸菌表达载体pLN并转化乳酸菌获得，还公开了该转化菌在制备具有疾病免疫治疗效果的口服活菌药物中的应用。本发明专利技术中TIM3Fv和CTB‑TIM3Fv融合基因转化乳酸菌可制备成活菌悬液、乳制品、活菌菌粉、菌片或胶囊等活菌制剂，作为免疫治疗活菌药物口服后能在人体肠道内增殖和定植，应用于肿瘤、病毒感染或细胞内细菌感染、原发性和继发性免疫低下等疾病的预防与治疗。

Transformation of tim3 human scFv fusion gene into Lactobacillus and its application

【技术实现步骤摘要】
TIM3人源单链抗体融合基因转化乳酸菌及其应用
本专利技术属于生物工程
，具体涉及TIM3人源单链抗体融合基因转化乳酸菌及其应用。
技术介绍
近年来，以免疫检查点(checkpoint)分子为靶点的免疫治疗是目前抗肿瘤研究的热点，多种免疫检查点抑制剂药物，如PD-1、PD-L1人源化抗体已经获准在临床应用，并获得了较好的疗效。恶性肿瘤之所以能逃避免疫监视，主要原因是恶性肿瘤细胞自身和免疫细胞都会表达一些免疫共抑制分子(co-inhibitorymolecular)，又称为免疫检查点(checkpoint)分子，产生免疫抑制，逃避机体的免疫监视。这也是肿瘤治疗需要突破的主要障碍。T细胞活化后会表达一系列免疫检查点分子，如细胞毒T细胞抗原4(CTLA-4)、受体程序性死亡因子1(programmeddeath1，PD-1)、T细胞免疫球蛋白粘蛋白分子3(Tcellimmunoglobulin-3,TIM3)、淋巴细胞活化基因3(lymphocyteactivationgene3，LAG-3，CD223)、T细胞含ITIM结构域的免疫球蛋白(TcellimmunoglobulinandITIMdomainprotein，TIGIT)等等。这些通过负反馈调节机制来控制免疫反应的强度和持续时间，防止过度免疫应答导致炎症反应和自身免疫性疾病。恶性肿瘤细胞自身，以及抗原递呈细胞(APC)、调节性T细胞(Treg)，抑制性免疫细胞等也表达一些免疫共抑制分子，参与免疫负调控。B7-H1(CD274)和B7-DC(CD273)是两个重要的免疫抑制分子，二者都是CD80(B7.1)的同源分子，都能与T细胞上的PD-1结合，抑制产生抗肿瘤免疫，抑制效应T细胞(Te)对肿瘤的杀伤作用。因而，二者又分别被称为PD-1配体1(PD-L1)和配体2(PD-L2)。PD-L1广泛表达于各种恶性肿瘤细胞，受干扰素γ(IFN-γ)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)等细胞因子的上调。PD-L2则主要表达于DC、巨噬细胞、肥大细胞等。PD-1主要在活化成熟的T细胞上有表达。未被激活的T细胞几乎没有PD-1的表达，只有T细胞活化后，才有PD-1表达。此外，在胸腺的双阴性(CD4-CD8-)T细胞、活化的NK细胞、单核细胞和未成熟的朗格汉斯细胞，PD-1低表达。近年来，针对PD-1及其配体PD-L1、PD-L2，以及CTLA-4等免疫抑制分子的靶向治疗已经成为抗肿瘤治疗研究的热点。PD-1、PD-L1抗体通过与对应分子的结合，阻断了PD-1/PD-L1,2的结合，解除了PD-1/PD-L1对免疫细胞的抑制作用，提高了Te对肿瘤细胞的细胞毒作用。此外，解除PD-1/PD-L2的免疫抑制可以在一定程度上促进机体产生抗肿瘤主动免疫，增加Te细胞的数量。PD-1人源抗体nivolumab和pembrolizumab，PD-L1抗体atezolizumab最初用于恶性黑色素瘤治疗，已先后获得日本、美国和澳大利亚等国FDA批准上市。PD-1、PD-L1、PD-L2和CTLA-4的人源化抗体或抑制剂在乳腺癌、结肠癌和肺癌等恶性肿瘤的临床治疗试验中获得了可喜疗效，目前，已有2种PD-1抗体和3种PD-L1抗体获批在欧美等几十个国家临床应用。然而，除经典型霍奇金淋巴瘤用PD-1或PD-L1抗体治疗有效率超过60％以外，在未经选择的实体瘤患者中，PD-1/PD-L1抗体的有效率只有10％-30％。这是因为PD-1/PD-L1抗体最主要的作用是提高Te细胞对肿瘤的杀伤作用，刺激机体产生主动抗肿瘤免疫的作用很小。而绝大多数肿瘤都存在高度异质性和免疫抑制问题，只有部分肿瘤患者有较好的免疫力，自身能产生足够多的活化淋巴细胞和Te细胞，也只有部分活化的淋巴细胞和少部分恶性肿瘤细胞上有PD-1或PD-L1表达。因此，恶性肿瘤需要多种因子、多种药物联合治疗才能取得理想的疗效。TIM-3是T细胞免疫球蛋白(TIM)家族的成员之一，主要在活化的T淋巴细胞，调节性T细胞(Treg)，天然免疫细胞(树突细胞、自然杀伤细胞、单核细胞)表面表达。TIM-3有多种配体，如磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine，PtdSer)、半乳凝素9(galectin-9)、高迁移蛋白B1(HMGB1)和癌胚抗原相关黏附分子1(CEACAM1)。TIM-3仅在Ⅰ类CD4+辅助T细胞(Th1)和CD8+细胞毒性T细胞(CTL)中上调，促进Treg形成，参与协同免疫抑制作用。TIM-3在T细胞在肿瘤中的损耗中起着关键作用。TIM-3被galectin-9、PtdSer激活后，会诱导Th1和CTL凋亡，抑制Te细胞的活性，导致免疫耐受。HMGB1主要参与天然免疫应答。HMGB1能与死细胞渗漏出来的DNA结合，通过Toll样受体(TLRs)被天然免疫细胞内吞激发天然免疫应答。HMGB1与TIM-3+细胞结合可抑制天然免疫反应。CEACAM1通常与TIM-3一起在CD4+和CD+T细胞上表达，二者可以形成异源二聚体，诱导Th1和CTL衰竭。TIM-3的异常高表达与癌症和慢性病毒感染密切相关。肿瘤患者，TIM-3不仅在T细胞和其他天然免疫细胞高表达，而且在部分肿瘤细胞本身(肾脏透明细胞癌)也高表达。TIM-3高表达与恶性细胞逃逸免疫监视密切相关。因此，TIM-3抗体成为恶性肿瘤和慢性病毒感染的免疫治疗的热点。用TIM-3抗体单独或与PD-1抗体联合治疗可以显著恢复Te细胞功能，恶性肿瘤和慢性病毒感染治疗实验中都显示出较好的疗效。TIM-3抗体与PD-1抗体联合用药可抑制PD-1抗体耐药性的产生。然而，现有检查点抑制剂，如PD-1、PD-L1抗体等免疫治疗药物存在生产成本高、用药不便两大固有缺点，限制了其在临床上推广使用。传统的生物药物(包括抗体)的生产都离不开蛋白的分离和纯化，必须注射途径给药，存在生产成本高和用药不便这两大固有缺点。比如，PD-1/PD-L1抗体平均起效时间大约是2-4个月。对大多数恶性肿瘤患者来说，PD-1/PD-L1抗体至少要用药1年；而晚期的、全身转移的患者，建议至少要用药2年。长期用PD-1/PD-L1抗体治疗，一般普通家庭都无力承担高昂的药费，也难于承受长期注射的痛苦。如果采用传统的生产方式制备TIM-3抗体，依然存在生产成本高、用药不便两大难于克服的问题。因此，有必要探索免疫治疗抗体药物新的表达生产方式和给药途径。胃肠道是最简便、经济的生物药物生成与转化的生物反应器，乳酸菌等益生菌是免疫治疗药物口服给药途径的良好载体。我们人体自身的胃肠道是一个复杂、动态的“微生态世界”，也是一个高效的生化代谢“工厂”。据估计,一个成人肠道内的细菌总数超过1014，其生化代谢的总量相当于肝脏的代谢总量。如果能有效地利用胃肠道这个“工厂”，把它作为一个药物生成与转化的生物反应器，无疑具有经济、便利、高效的优点，为疾病预防和治疗提供一条新途径。乳酸菌、双歧杆菌是肠道生物反应器最合适、最安全的宿主菌。乳酸菌、双歧杆菌等益生菌长期生长存在于口腔、阴道和人体消化道，尤其是本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.TIM-3人源单链抗体融合基因转化乳酸菌，其特征是：包括TIM3Fv基因或CTB-TIM3Fv融合基因转化乳酸菌，是将所述TIM3Fv基因或CTB-TIM3Fv融合基因插入到乳酸菌表达载体pLN并转化乳酸菌获得，其中所述CTB-TIM3Fv融合基因主要由TIM3Fv基因和CTB基因连接而成，且在所述TIM3Fv基因与所述CTB基因之间引入弗林蛋白酶酶切多肽序列对应的cDNA序列，在所述TIM3Fv基因和所述CTB-TIM3Fv融合基因的N端引入分泌性信号肽SPK1。/n

【技术特征摘要】
1.TIM-3人源单链抗体融合基因转化乳酸菌，其特征是：包括TIM3Fv基因或CTB-TIM3Fv融合基因转化乳酸菌，是将所述TIM3Fv基因或CTB-TIM3Fv融合基因插入到乳酸菌表达载体pLN并转化乳酸菌获得，其中所述CTB-TIM3Fv融合基因主要由TIM3Fv基因和CTB基因连接而成，且在所述TIM3Fv基因与所述CTB基因之间引入弗林蛋白酶酶切多肽序列对应的cDNA序列，在所述TIM3Fv基因和所述CTB-TIM3Fv融合基因的N端引入分泌性信号肽SPK1。


2.根据权利要求1所述的TIM-3人源单链抗体融合基因转化乳酸菌，其特征是：所述转化乳酸...

【专利技术属性】
技术研发人员：曾位森，陈泽荣，范宏英，白杨，孟晓静，
申请(专利权)人：广州维生君生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44