人可溶性CD80融合基因转化乳酸菌及其应用制造技术

本发明专利技术公开了人可溶性CD80(hsCD80)融合基因转化乳酸菌，包括hsCD80基因或CTB‑hsCD80融合基因转化乳酸菌，是将所述hsCD80基因或CTB‑hsCD80融合基因插入到乳酸菌表达载体pLN并转化乳酸菌获得，还公开了该转化菌在制备具有肿瘤免疫治疗效果的口服活菌药物中的应用。本发明专利技术中hsCD80和CTB‑hsCD80融合基因转化乳酸菌可制备成活菌悬液、乳制品、活菌菌粉、菌片或胶囊等活菌制剂，作为免疫治疗活菌药物口服后能在人体肠道内增殖和定植，应用于肿瘤、病毒感染或细胞内细菌感染、原发性和继发性免疫低下等疾病的预防与治疗。

Transformation of human soluble CD80 fusion gene into Lactobacillus and its application

【技术实现步骤摘要】
人可溶性CD80融合基因转化乳酸菌及其应用
本专利技术属于人可溶性CD80(简称hsCD80)基因
，具体涉及人可溶性CD80融合基因转化乳酸菌及其应用。
技术介绍
近年来，以免疫检查点(checkpoint)分子为靶点的免疫治疗是目前抗肿瘤研究的热点，多种免疫检查点抑制剂药物，如PD-1、PD-L1人源化抗体已经获准在临床应用，并获得了较好的疗效。恶性肿瘤之所以能逃避免疫监视，主要原因是恶性肿瘤细胞自身和免疫细胞都会表达一些免疫共抑制分子(co-inhibitorymolecular)，又称为免疫检查点(checkpoint)分子，产生免疫抑制，逃避机体的免疫监视。这也是肿瘤治疗需要突破的主要障碍。B7-H1(CD274)和B7-DC(CD273)是两个重要的免疫抑制分子，二者都是CD80(B7.1)的同源分子，都能与T细胞上的受体程序性死亡因子1(programmeddeath1，PD-1)结合，抑制产生抗肿瘤免疫，抑制效应T细胞(Te)对肿瘤的杀伤作用。因而，二者又分别被称为PD-1配体1(PD-L1)和配体2(PD-L2)。PD-L1广泛表达于各种恶性肿瘤细胞，受干扰素γ(IFN-γ)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)等细胞因子的上调。PD-L2则主要表达于DC、巨噬细胞、肥大细胞等。PD-L1和PD-L2都能与T细胞上的受体PD-1或者CD80结合。一方面抑制T细胞的活化，诱导T细胞凋亡；另一方面抑制Te细胞对肿瘤细胞产生的细胞毒作用。近年来，针对PD-1及其配体PD-L1、PD-L2，以及CTLA-4等免疫抑制分子的靶向治疗已经成为抗肿瘤治疗研究的热点。PD-1、PD-L1、PD-L2和CTLA-4的人源化抗体或抑制剂在乳腺癌、结肠癌和肺癌等恶性肿瘤的临床治疗试验中获得了可喜疗效，PD-1人源抗体nivolumab和pembrolizumab，PD-L1抗体atezolizumab已获得日本、美国和澳大利亚等国FDA批准，应用于恶性肿瘤治疗。除PD-1外，免疫细胞活化后还表达许多检查点分子，如细胞毒T细胞抗原4(CTLA-4)、TIM3、LAG-3等。这些检查点分子通过负反馈调节机制防止免疫反应过程中发生过度免疫和自身免疫。CTLA-4是CD80的负调节受体，主要存在于活化的T细胞、调节性T细胞(Treg)和记忆T细胞(Tm)细胞。CD80与CTLA-4结合抑制辅助T细胞(Th)、Tm细胞活化，刺激Treg细胞增殖，诱导产生免疫耐受。CTLA-4抗体ipilimumab是最早获准上市的检查点抗体药物，主要用于转移性黑色素瘤治疗。TIM3和LAG-3主要表达于活化的CD4+和CD8+T细胞，抑制Th1的活化和Te的杀伤作用。TIM3和LAG-3的抑制剂或抗体同样可以提高Te对肿瘤细胞的杀伤作用。但是，免疫检查点抑制剂在临床上的适用范围较小。只有不到三分之一的肿瘤患者用PD-1抗体治疗后疗效确切，大多数肿瘤患者用药后疗效不佳或无效。这是因为检查点抑制剂主要通过阻断免疫抑制通路起作用，提高机体已经活化的免疫细胞的抗肿瘤作用，而在激发抗肿瘤主动免疫方面的功效较低。比如，PD-1抗体只能提高Te对肿瘤细胞的免疫效应，PD-L1抗体只对PD-L1阳性肿瘤有较好的疗效。但是，免疫细胞和恶性肿瘤通常表达多种不同的免疫抑制分子，不同个体免疫抑制分子表达水平差异较大，也不是所有患者能够自身产生较多的抗肿瘤Te细胞。因此，要提高免疫治疗药物的抗肿瘤疗效，必须首先激发机体的抗肿瘤主动免疫，或激发主动免疫药物与检查点抑制剂联合用药，才能获得较好的疗效。CD80是重要的免疫共刺激分子(co-stimulatemoleculars，CSMs)，在抗肿瘤和抗病毒感染免疫中发挥重要作用。由于恶性肿瘤存在免疫抑制机制，必须要有免疫共刺激分子参与，才能激发机体产生有效的抗肿瘤免疫反应。CD80是最为重要的免疫共刺激分子，最早在活化的B淋巴细胞中发现，称为B7.1。后来的研究发现，CD80广泛分布于抗原递呈细胞(APC)、树突状细胞(DC)、T细胞、B细胞和髓系细胞。人CD80是由288个氨基酸残基(aa)组成的Ⅰ型跨膜蛋白，基因位于3号染色体长臂(3q3.1)。其中1-34aa为信号肽，35-242为胞外结构，含两段免疫球蛋白样结构区。243-263aa为跨膜的螺旋结构，264-288为胞内结构区。小鼠CD80由306个aa组成，与人CD80氨基酸序列的同源性很高，有相似的结构特征和生物学作用。已知CD80有两个主要受体，一个是CD28，另一个是CTLA-4。CD28在T细胞上组成性表达。CD80通过与CD28结合，刺激初始T细胞增殖与活化，使之分化为Ⅰ类辅助T细胞(Th1)，并分泌白细胞介素2(IL-2)，促进细胞免疫。CD80-CD28的结合反过来也刺激APC细胞分泌IL-6，进一步刺激T细胞增殖与活化。CTLA-4是负调节受体，主要存在于Te、Th1、Treg和Tm细胞。CD80与CTLA-4结合抑制Th、Tm细胞活化，刺激Treg细胞增殖，诱导产生免疫耐受。CD80具有活化和调节Tm、Te和Treg的作用。小鼠敲除CD80基因后，免疫力显著下降。经淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)刺激后，外周血和脾脏Th1、Treg、Tm和Te细胞数量全面减少。仅含胞外结构域的可溶性CD80(简称sCD80)不仅能激活细胞免疫反应，并且能阻止免疫抑制分子的作用，显示出非常好的抗肿瘤作用，有望成为高效、适用范围广的免疫治疗新药。以往，CD80主要作为免疫佐剂分子，通过转染细胞或与抗原共表达的方式用于制备肿瘤疫苗或病原微生物疫苗。人可溶性CD80(简称hsCD80)基因转染人黑色素瘤细胞，能克服PD-L1所引起的免疫抑制作用，诱导产生免疫反应，抑制在接种到小鼠皮下的人黑色素瘤异位瘤的生长和转移。最新研究显示，小鼠可溶性CD80(sCD80)能显著提高小鼠及人外周血淋巴细胞的抗肿瘤免疫反应。注射sCD80-Fc后，荷瘤小鼠活化淋巴细胞数量、效应淋巴细胞数量及IFN-γ分泌量皆显著增高，存活时间大大延长。sCD80可以通过多条途径发挥抗肿瘤作用：①通过与T细胞膜上CD28的相互作用，增强特异性抗肿瘤免疫反应；②通过下调PD-L1的表达，以及与PD-L1的竞争结合，阻碍免疫抑制分子PD-L1、PD-L2与受体PD-1的结合，增强Te的抗肿瘤免疫杀伤效应；③CD80还能与其他活化的检查点分子CTLA-4、TIM3和LAG-3等分子结合，克服免疫耐受，激发抗肿瘤免疫反应。CD80能刺激CD28基因敲除小鼠T淋巴细胞的分化。比较研究结果显示，可溶性CD80的抗肿瘤疗效显著好于抗PD-1、抗PD-L1和抗CTLA-4抗体，而且适用范围更广，适合各种恶性肿瘤的治疗，显示出非常好的抗肿瘤治疗前景。然而，现有的免疫治疗药物除了适用范围小以外，还存在生产成本高、用药不便两大固有缺点，限制了其在临床上推广使用。传统的生物药物(包括抗体)的生产都离不开蛋白的分离和纯化，必须注射途径给药，存在生产成本高和用药不便这两大固有缺点。如果采用本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.人可溶性CD80融合基因转化乳酸菌，其特征是：包括hsCD80基因或CTB-hsCD80融合基因转化乳酸菌，是将所述hsCD80基因或CTB-hsCD80融合基因插入到乳酸菌表达载体pLN并转化乳酸菌获得，其中所述CTB-hsCD80融合基因主要由hsCD80基因和CTB基因连接而成，且在所述hsCD80基因与所述CTB基因之间引入弗林蛋白酶酶切多肽序列对应的cDNA序列，在所述hsCD80基因的胞外区结构域的N端引入分泌性信号肽SPK1。/n

【技术特征摘要】
1.人可溶性CD80融合基因转化乳酸菌，其特征是：包括hsCD80基因或CTB-hsCD80融合基因转化乳酸菌，是将所述hsCD80基因或CTB-hsCD80融合基因插入到乳酸菌表达载体pLN并转化乳酸菌获得，其中所述CTB-hsCD80融合基因主要由hsCD80基因和CTB基因连接而成，且在所述hsCD80基因与所述CTB基因之间引入弗林蛋白酶酶切多肽序列对应的cDNA序列，在所述hsCD80基因的胞外区结构域的N端引入分泌性信号肽SPK1。


2.根据权利要求1所述的人可溶性CD80融合基因转化乳酸菌，其特征是：所述转化乳酸菌不含耐药基因...

【专利技术属性】
技术研发人员：曾位森，林子青，白杨，范宏英，孟晓静，
申请(专利权)人：广州维生君生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44