产N-乙酰谷氨酸的基因工程菌及其构建方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种产N‑乙酰谷氨酸的基因工程菌及其构建方法与应用。本发明专利技术所提供的产N‑乙酰谷氨酸的基因工程菌的构建方法包括：将N‑乙酰谷氨酸合成酶基因导入宿主菌得到产N‑乙酰谷氨酸(NAG)的重组菌，通过阻断N‑乙酰谷氨酸分解代谢途径，以及改善前体乙酰辅酶A的供应提高NAG的产量。利用本发明专利技术所构建的产NAG的基因工程菌生产NAG，具有以下优点：通过导入优良性状的N‑乙酰谷氨酸合成酶得到能够产NAG的工程菌；通过阻断N‑乙酰谷氨酸分解代谢途径使NAG得以高效积累；通过前体乙酰辅酶A供应的改善，提高了NAG的合成效率。实验证明，本发明专利技术所制备的产N‑乙酰谷氨酸的重组菌可以高效地合成N‑乙酰谷氨酸。

N-acetylglutamic acid producing gene engineering bacteria and its construction method and Application

【技术实现步骤摘要】
产N-乙酰谷氨酸的基因工程菌及其构建方法与应用
本专利技术涉及基因工程领域，具体涉及一种产N-乙酰谷氨酸的基因工程菌及其构建方法与应用。
技术介绍
自十九世纪50年代作为大肠杆菌精氨酸生物合成的中间体被鉴定以来，N-乙酰谷氨酸的多种生理功能被不断发现。N-乙酰谷氨酸是L-谷氨酸的氨基被乙酰化的产物，作为一种氨基酸衍生物，其存在于很多食物包括水果、蔬菜、谷物、牛奶、咖啡、肉等中。N-乙酰谷氨酸有两个主要的生理功能，首先N-乙酰谷氨酸是微生物及植物精氨酸生物合成的第一个中间体，对L-鸟氨酸和瓜氨酸的合成也是必须的。精氨酸是一种重要的功能性氨基酸，在动物细胞信息传递和应用代谢中起重要作用，但受其价格高且与赖氨酸、色氨酸和组氨酸有拮抗作用等未能作为饲料添加剂在动物生产中大量推广使用，而N-乙酰谷氨酸作为精氨酸的替代品添加在饲料中能够促进动物内源精氨酸的合成。其次，N-乙酰谷氨酸是尿素循环的第一个酶——氨基甲酰磷酸合成酶CPSI的变构激活剂，能够促进尿素循环，防止氨中毒。此外，大脑中的N-乙酰谷氨酸是神经肽乙酰天冬酰胺谷氨酸转换的中间体；在根瘤菌固氮期间，N-乙酰谷氨酸作为一种从细菌释放的胞外信号，也能够影响根毛发育和其后的结节发育。目前的研究发现，有很多不同来源的基因都能够编码合成N-乙酰谷氨酸的酶。研究最多的是典型的细菌来源的N-乙酰谷氨酸合成酶NAGS，它是一种双功能的酶，同时具有N-乙酰谷氨酸合成酶和N-乙酰谷氨酸激酶活性，也即精氨酸合成的前两个步骤，这种酶由argA单基因编码，包含两个结构域，C端的N-乙酰转移酶(NAT)结构域和N端的氨基酸激酶(AAK)结构域。另一个研究较多的基因是argJ，能够编码单功能或者双功能的乙酰转移酶，催化乙酰鸟氨酸和谷氨酸(单功能)及乙酰辅酶A和谷氨酸(双功能)合成N-乙酰谷氨酸。细菌中还存在一些其它的非典型的N-乙酰谷氨酸合成酶NAGS，包括短链的只具有乙酰转移酶活性的S-NAGS，N端与argH融合的H-NAGS，以及2013年发现的来源于谷氨酸棒杆菌的C-NAGS。合成N-乙酰谷氨酸的另一个前体——乙酰辅酶A，是中心碳代谢的重要中间物，参与多个生物反应。在大肠杆菌中，乙酰辅酶A主要来源于丙酮酸的脱羧反应，在有氧的条件下由PDH催化，厌氧条件下由PFL催化脱羧。乙酰辅酶A也可以从乙酸或者脂肪酸获得。在氧气充足的情况下，乙酰辅酶A主要经过TCA循环产能，也可以合成乙酸、乙醇等，当然也可以用于脂肪酸的合成。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种产N-乙酰谷氨酸的基因工程菌及其构建方法与应用。第一方面，本专利技术要求保护一种构建产N-乙酰谷氨酸的基因工程菌的方法。本专利技术所提供的构建产N-乙酰谷氨酸的基因工程菌的方法，可包括如下步骤：将N-乙酰谷氨酸合成酶基因导入宿主菌得到产N-乙酰谷氨酸的重组菌；通过阻断N-乙酰谷氨酸分解代谢途径以及改善前体乙酰辅酶A(Acetyl-CoA)的供应等策略提高NAG的合成；所述宿主菌为突变型大肠杆菌或者野生型大肠杆菌；所述突变型大肠杆菌为下述A1)至A5)的任一种：A1)所述突变型大肠杆菌为对所述野生型大肠杆菌进行下述a1)-a5)的全部改造后得到的所述野生型大肠杆菌的突变体(在本专利技术中，该突变型大肠杆菌具体为NAG05)：a1)用葡糖激酶基因(glk)替换所述野生型大肠杆菌基因组中的D-葡萄糖PTS通透酶基因(ptsG)，用D-乳糖转运蛋白基因(zglf)(优选运动发酵单胞菌(Zymomonasmobilis)来源的zglf)替换所述野生型大肠杆菌基因组中的半乳糖操纵子的调节子基因(galR)，用乙酰辅酶A合成酶基因(acs)替换所述野生型大肠杆菌基因组中的丙酮酸氧化酶基因(poxB)。本专利技术中，将该突变型大肠杆菌SG104，其基因型为E.coliBW25113ΔptsG::glkΔgalR::zglfΔpoxB::acs。a2)将所述野生型大肠杆菌基因组中的N-乙酰谷氨酸激酶基因(argB)敲除。该改造以“ΔargB”表示。a3)将所述野生型大肠杆菌基因组中的N-乙酰谷氨酸合成酶基因(argA)敲除。该改造以“ΔargA”表示。a4)将所述野生型大肠杆菌基因组中的乳酸脱氢酶基因(ldhA)敲除。该改造以“ΔldhA”表示。a5)将所述野生型大肠杆菌基因组中的乙酰磷酸转移酶基因(pta)敲除。该改造以“Δpta”表示。A2)所述突变型大肠杆菌为对所述野生型大肠杆菌进行所述a1)的改造后得到的所述野生型大肠杆菌的突变体(在本专利技术中，该突变型大肠杆菌具体为SG104)。A3)所述突变型大肠杆菌为对所述野生型大肠杆菌进行所述a1)和所述a2)的改造后得到的所述野生型大肠杆菌的突变体(在本专利技术中，该突变型大肠杆菌具体为NAG01)。A4)所述突变型大肠杆菌为对野生型大肠杆菌进行所述a1)所述a2)和所述a3)的改造后得到的所述野生型大肠杆菌的突变体(在本专利技术中，该突变型大肠杆菌具体为NAG02)。A5)所述突变型大肠杆菌为对野生型大肠杆菌进行所述a1)所述a2)所述a3)和所述a4)的改造后得到的所述野生型大肠杆菌的突变体(在本专利技术中，该突变型大肠杆菌具体为NAG03)。上述敲除和替换均可通过同源重组实现。进一步地，被导入所述宿主菌的所述N-乙酰谷氨酸合成酶基因所编码的蛋白质可为如b1)至b2)中任一所示：b1)氨基酸序列如序列表中序列1所示的蛋白质；b2)将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有N-乙酰谷氨酸合成酶活性的由b1)衍生的蛋白质。进一步地，所述葡糖激酶基因可编码下述c1)或c2)所示的蛋白质：c1)由Acession号NP_416889所示的氨基酸序列组成的蛋白质；c2)由Acession号NP_416889所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有葡萄糖激酶活性的由c1)衍生的蛋白质。进一步地，所述D-乳糖转运蛋白基因可为来源于运动发酵单胞菌来源的D-乳糖转运蛋白基因，可编码下述d1)或d2)所示的蛋白质：d1)由序列表中序列4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；d2)由序列表中序列4所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有D-乳糖转运蛋白活性的由d1)衍生的蛋白质。进一步地，所述乙酰辅酶A合成酶基因可编码下述e1)或e2)所示的蛋白质：e1)由Acession号NP_418493所示的氨基酸序列组成的蛋白质；e2)由Acession号NP_418493所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有乙酰辅酶A合成酶活性的由e1)衍生的蛋白质。进一步地，所述D-葡萄糖PTS通透酶基因可编码下述f1)或f2)所示的蛋白质：f1)由Acession号NP_415619所示的氨基酸序列组成的蛋白质；本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种构建产N-乙酰谷氨酸的基因工程菌的方法，包括如下步骤：将N-乙酰谷氨酸合成酶基因导入宿主菌得到产N-乙酰谷氨酸的重组菌，即为所述工程菌；所述宿主菌为突变型大肠杆菌或者野生型大肠杆菌；所述突变型大肠杆菌为下述A1)至A5)的任一种：/nA1)所述突变型大肠杆菌为对所述野生型大肠杆菌进行下述a1)-a5)全部的改造后得到的所述野生型大肠杆菌的突变体：/na1)用葡糖激酶基因替换所述野生型大肠杆菌基因组中的D-葡萄糖PTS通透酶基因，用D-乳糖转运蛋白基因替换所述野生型大肠杆菌基因组中的半乳糖操纵子的调节子基因，用乙酰辅酶A合成酶基因替换所述野生型大肠杆菌基因组中的丙酮酸氧化酶基因；/na2)将所述野生型大肠杆菌基因组中的N-乙酰谷氨酸激酶基因敲除；/na3)将所述野生型大肠杆菌基因组中的N-乙酰谷氨酸合成酶基因敲除；/na4)将所述野生型大肠杆菌基因组中的乳酸脱氢酶基因敲除；/na5)将所述野生型大肠杆菌基因组中的乙酰磷酸转移酶基因敲除；/nA2)所述突变型大肠杆菌为对所述野生型大肠杆菌进行所述a1)的改造后得到的所述野生型大肠杆菌的突变体；/nA3)所述突变型大肠杆菌为对所述野生型大肠杆菌进行所述a1)和所述a2)的改造后得到的所述野生型大肠杆菌的突变体；/nA4)所述突变型大肠杆菌为对野生型大肠杆菌进行所述a1)、所述a2)和所述a3)的改造后得到的所述野生型大肠杆菌的突变体；/nA5)所述突变型大肠杆菌为对野生型大肠杆菌进行所述a1)、所述a2)、所述a3)和所述a4)的改造后得到的所述野生型大肠杆菌的突变体。/n...

【技术特征摘要】
1.一种构建产N-乙酰谷氨酸的基因工程菌的方法，包括如下步骤：将N-乙酰谷氨酸合成酶基因导入宿主菌得到产N-乙酰谷氨酸的重组菌，即为所述工程菌；所述宿主菌为突变型大肠杆菌或者野生型大肠杆菌；所述突变型大肠杆菌为下述A1)至A5)的任一种：
A1)所述突变型大肠杆菌为对所述野生型大肠杆菌进行下述a1)-a5)全部的改造后得到的所述野生型大肠杆菌的突变体：
a1)用葡糖激酶基因替换所述野生型大肠杆菌基因组中的D-葡萄糖PTS通透酶基因，用D-乳糖转运蛋白基因替换所述野生型大肠杆菌基因组中的半乳糖操纵子的调节子基因，用乙酰辅酶A合成酶基因替换所述野生型大肠杆菌基因组中的丙酮酸氧化酶基因；
a2)将所述野生型大肠杆菌基因组中的N-乙酰谷氨酸激酶基因敲除；
a3)将所述野生型大肠杆菌基因组中的N-乙酰谷氨酸合成酶基因敲除；
a4)将所述野生型大肠杆菌基因组中的乳酸脱氢酶基因敲除；
a5)将所述野生型大肠杆菌基因组中的乙酰磷酸转移酶基因敲除；
A2)所述突变型大肠杆菌为对所述野生型大肠杆菌进行所述a1)的改造后得到的所述野生型大肠杆菌的突变体；
A3)所述突变型大肠杆菌为对所述野生型大肠杆菌进行所述a1)和所述a2)的改造后得到的所述野生型大肠杆菌的突变体；
A4)所述突变型大肠杆菌为对野生型大肠杆菌进行所述a1)、所述a2)和所述a3)的改造后得到的所述野生型大肠杆菌的突变体；
A5)所述突变型大肠杆菌为对野生型大肠杆菌进行所述a1)、所述a2)、所述a3)和所述a4)的改造后得到的所述野生型大肠杆菌的突变体。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：被导入所述宿主菌的所述N-乙酰谷氨酸合成酶基因所编码的蛋白质为如b1)至b2)中任一所示：
b1)氨基酸序列如序列表中序列1所示的蛋白质；
b2)将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有N-乙酰谷氨酸合成酶活性的由b1)衍生的蛋白质。


3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述葡糖激酶基因编码下述c1)或c2)所示的蛋白质：
c1)由Acession号NP_416889所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
c2)由Acession号NP_416889所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有葡萄糖激酶活性的由c1)衍生的蛋白质；
所述D-乳糖转运蛋白基因为来源于运动发酵单胞菌来源的D-乳糖转运蛋白基因，编码下述d1)或d2)所示的蛋白质：
d1)由序列表中序列4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
d2)由序列表中序列4所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有D-乳糖转运蛋白活性的由d1)衍生的蛋白质；
所述乙酰辅酶A合成酶基因编码下述e1)或e2)所示的蛋白质：
e1)由Acession号NP_418493所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
e2)由Acession号NP_418493所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有乙酰辅酶A合成酶活性的由e1)衍生的蛋白质；
所述D-葡萄糖PTS通透酶基因编码下述f1)或f2)所示的蛋白质：
f1)由Acession号NP_415619所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
f2)由Acession号NP_415619所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有D-葡萄糖PTS通透酶活性的由f1)衍生的蛋白质；
所述半乳糖操纵子的调节子基因编码下述g1)或g2)所示的蛋白质：
g1)由Acession号NP_417314所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
g2)由Acession号NP_417314所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有半乳糖操纵子的调节子活性的由g1)衍生的蛋白质；
所述丙酮酸氧化酶基因编码下述h1)或h2)所示的蛋白质：
h1)由Acession号NP_415392所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
h2)由Acession号NP_415392所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有丙酮酸氧化酶活性的由h1)衍生的蛋白质；
所述N-乙酰谷氨酶激酶基因编码下述i1)或i2)所示的蛋白质：
i1)由Accession号NP_418394所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
i2)由Accession号NP_418394所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有N-乙酰谷氨酶激酶活性的由i1)衍生的蛋白质；
所述野生型大肠杆菌基因组中的所述N-乙酰谷氨酶合成酶基因编码下述j1)或j2)所示的蛋白质：
j1)由Accession号NP_417295所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
j2)由Accession号NP_417295所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有N-乙酰谷氨酶合成酶活性的由j1)衍生的蛋白质；
所述乳酸脱氢酶基因编码下述...

【专利技术属性】
技术研发人员：林白雪，张莎莎，杨巍，王鹏超，陶勇，
申请(专利权)人：中国科学院微生物研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11