一种高效生产GDP-岩藻糖的大肠杆菌工程菌株制造技术

本发明专利技术提供了一种高效生产GDP‑岩藻糖的大肠杆菌生产菌株，属于基因工程、微生物代谢工程技术领域。本发明专利技术以葡萄糖为底物，通过组合调控代谢通路中的磷酸甘露糖变位酶(ManB)、GDP‑甘露糖焦磷酸化酶(ManC)、GDP‑甘露糖4,6‑脱水酶(Gmd)和GDP‑岩藻糖合成酶(WcaG)的表达从而缓解GDP‑岩藻糖合成通路的代谢压力。本发明专利技术还通过CRISPR/Cas9基因编辑系统敲除大肠杆菌中分解GDP‑岩藻糖的基因UDP‑葡萄糖脂质载体转移酶(WcaJ)以及加强代谢通路中的辅因子的再生进一步提高胞内GDP‑岩藻糖的积累。

An E.coli engineering strain with high production efficiency of GDP fucose

【技术实现步骤摘要】
一种高效生产GDP-岩藻糖的大肠杆菌工程菌株
本专利技术涉及一种高效生产GDP-岩藻糖的大肠杆菌工程菌株，属于基因工程、微生物代谢工程

技术介绍
GDP-岩藻糖是一种核苷酸糖，在各种生物体中被广泛用作糖基供体和代谢中间体，是生命代谢调节过程中必不可少的物质。GDP-岩藻糖主要被用作蛋白质糖基化的重要糖基供体，并且是真核生物中其他糖核苷酸合成的前体，并且主要参与原核生物中岩藻糖基化寡糖的生物合成。人乳寡糖(HMOs)是人乳中最丰富的固体成分之一。其生物学功能，例如改善肠道菌群，抑制病原体粘附，调节免疫应答和促进大脑发育，对婴儿发育具有广阔的前景发展。在HMOs中，岩藻糖基化低聚糖的比例约为50％，这需要GDP-岩藻糖作为岩藻糖供体，并通过岩藻糖基转移酶的功能表达来合成与乳糖或更复杂的新生寡糖的岩藻糖苷键。然而，由于GDP-岩藻糖可用性的限制，岩藻糖基化HMO的大规模生产可能是艰巨的任务。作为岩藻糖基化的HMOs生物合成中必不可少的前体，有效生产GDP-岩藻糖意义重大。目前主要有两个代谢通路可以生产GDP-岩藻糖，分别是从头合成途径和补救途径。在从头合成途径中，6-磷酸果糖经过6-磷酸甘露糖异构酶(ManA)、磷酸甘露糖变位酶(ManB)和GDP-甘露糖焦磷酸化酶(ManC)三个酶生成GDP-甘露糖。其中ManC的酶反应需要辅因子鸟苷5'-三磷酸(GTP)。GDP-甘露糖再经过GDP-甘露糖4,6-脱水酶(Gmd)和GDP-岩藻糖合成酶(WcaG)两个酶三步反应最终生成目的产物GDP-岩藻糖。其中WcaG的酶反应需要辅因子NADPH参与。补救途径则需要脆弱拟杆菌来源的双功能酶岩藻糖激酶/岩藻糖-1-磷酸鸟苷酰转移酶(Fkp)直接将外界提供的岩藻糖转化为GDP-岩藻糖。该过程同样需要GTP作为辅因子。磷酸戊糖途径是提供细胞内NADPH的重要途径，而葡萄糖6-磷酸脱氢酶Zwf可以促进NADPH的再生。另外，在鸟苷核苷酸生物合成途径中，鸟苷-肌苷激酶Gsk可以将肌苷和鸟苷转化为反应过程中的重要辅因子GTP。迄今为止，已经开发了几种重组微生物用于生物合成GDP-岩藻糖。最近的一项研究利用了Lactococcuslactissubsp.cremorisNZ9000表达4个关键酶ManB、ManC、Gmd和WcaG，并以甘露糖6-磷酸为底物通过一锅法合成了GDP-岩藻糖。尽管底物的转化效率相对较高，但是GTP的再生对于通过多酶级联反应进一步生产GDP-岩藻糖是一个巨大的挑战。Lee等人基于工程化大肠杆菌中的从头途径，做了一系列工作来增加GDP-岩藻糖的产量。通过优化碳源，过量表达关键酶，加强作为辅因子的NADPH或GTP的再生以及调节分批补料发酵模式，GDP-岩藻糖的产量从55.2mg/L显著提高至305.5mg/L。然而上述产量是在使用2.5L的发酵罐进行分批补料发酵和持续充足的葡萄糖供应使得菌体密度大幅度提高的情况下，得到的较高的胞内GDP-岩藻糖积累，但在摇瓶中的产物积累小于10mg/L。此外，在上述例子中，研究人员并未对从头合成途径进行模块化的调节，仅考虑单个变量并以线性模式调节整个代谢途径(简单过量表达GDP-岩藻糖合成途径涉及到的酶)，或单一的加强NADPH的再生的或者是GTP再生，这可能会导致代谢负担和通量失衡，无法实现全局最优的产量。
技术实现思路
针对现有的技术难点及存在的问题，本专利技术提供了一种高效生产GDP-岩藻糖的大肠杆菌工程菌及其构建方法。本专利技术的第一个目的是提供一种高效生产GDP-岩藻糖的大肠杆菌工程菌，所述大肠杆菌工程菌组合调控磷酸甘露糖变位酶ManB、GDP-甘露糖焦磷酸化酶ManC、GDP-甘露糖4,6-脱水酶Gmd和GDP-岩藻糖合成酶WcaG的表达。在本专利技术的一种实施方式中，所述大肠杆菌工程菌还加强葡萄糖6-磷酸脱氢酶Zwf和鸟苷-肌苷激酶Gsk的表达。在本专利技术的一种实施方式中，所述大肠杆菌工程菌还沉默UDP-葡萄糖脂质载体转移酶WcaJ的表达。在本专利技术的一种实施方式中，所述大肠杆菌工程菌的宿主菌为大肠杆菌BL21(DE3)，表达载体为pACYCDuet-1、pETuet-1和pCDFDuet-1。在本专利技术的一种实施方式中，所述大肠杆菌工程菌以pACYCDuet-1表达manC-manB，以pETuet-1表达gmd-wcaG，以pCDFDuet-1表达gsk-zwf。在本专利技术的一种实施方式中，ManB、ManC、Gmd、WcaG、Gsk和Zwf的基因来源于大肠杆菌(Escherichiacoli)MG1655，核苷酸序列依次为SEQIDNO.1～6。在本专利技术的一种实施方式中，以标准核糖体结合位点和野生型核糖体结合位点替换大肠杆菌工程菌中pACYCDuet-1-manC-manB和pETDuet-1-gmd-wcaG质粒本身的核糖体结合位点。在本专利技术的一种实施方式中，核糖体结合位点RBS-32、RBS-ori、RBS-WT(manB)、RBS-WT(manC)、RBS-WT(gmd)和RBS-WT(wcaG)的核苷酸序列依次为SEQIDNO.7～12。本专利技术的第二个目的是提供一种提高大肠杆菌产GDP-岩藻糖能力的方法，其特征在于，组合调控磷酸甘露糖变位酶ManB、GDP-甘露糖焦磷酸化酶ManC、GDP-甘露糖4,6-脱水酶Gmd和GDP-岩藻糖合成酶WcaG的表达；所述调控表达是采用高拷贝表达元件调控Gmd和WcaG的表达，采用低拷贝表达元件调控ManB和ManC的表达。本专利技术的第三个目的是提供一种高效生产GDP-岩藻糖的大肠杆菌工程菌的构建方法，包括如下步骤：(1)构建pCDFDuet-1-gsk-zwf重组表达载体；(2)构建pACYCDuet-1-manC-manB、pETDuet-1-manC-manB、pCDFDuet-1-manC-manB、pACYCDuet-1-gmd-wcaG、pETDuet-1-gmd-wcaG、pCDFDuet-1-gmd-wcaG重组表达载体，筛选出具有最高GDP-岩藻糖产量的重组质粒组合；(3)以标准核糖体结合位点和野生型核糖体结合位点替换筛选出的pACYCDuet-1-manC-manB和pETDuet-1-gmd-wcaG质粒本身的核糖体结合位点，并比较在不同RBS控制下具有最高GDP-岩藻糖产量的重组表达载体；(4)采用CRISPR/Cas9基因编辑系统敲除大肠杆菌BL21(DE3)染色体中的WcaJ基因；(5)以敲除了wcaJ基因的大肠杆菌BL21(DE3)为宿主，过表达pCDFDuet-1-gsk-zwf和筛选出的pACYCDuet-1-manC-manB和pETDuet-1-gmd-wcaG重组表达载体。本专利技术的第四个目的是提供一种高效生产GDP-岩藻糖的大肠杆菌工程菌的发酵方法，是以所述基因工程菌为发酵微生物，利用葡萄糖作为碳源合成GDP-岩藻糖。本专利技术还要本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种高效生产GDP-岩藻糖的大肠杆菌工程菌，其特征在于，组合调控磷酸甘露糖变位酶ManB、GDP-甘露糖焦磷酸化酶ManC、GDP-甘露糖4,6-脱水酶Gmd和GDP-岩藻糖合成酶WcaG的表达；所述调控表达是采用高拷贝表达元件调控Gmd和WcaG的表达，采用低拷贝表达元件调控ManB和ManC的表达。/n

【技术特征摘要】
1.一种高效生产GDP-岩藻糖的大肠杆菌工程菌，其特征在于，组合调控磷酸甘露糖变位酶ManB、GDP-甘露糖焦磷酸化酶ManC、GDP-甘露糖4,6-脱水酶Gmd和GDP-岩藻糖合成酶WcaG的表达；所述调控表达是采用高拷贝表达元件调控Gmd和WcaG的表达，采用低拷贝表达元件调控ManB和ManC的表达。


2.根据权利要求1所述的大肠杆菌工程菌，其特征在于，还加强葡萄糖6-磷酸脱氢酶Zwf和鸟苷-肌苷激酶Gsk的表达。


3.根据权利要求1或2所述的大肠杆菌工程菌，其特征在于，沉默UDP-葡萄糖脂质载体转移酶WcaJ的表达。


4.根据权利要求1～3任一所述的一种大肠杆菌工程菌，其特征在于，所述工程菌的宿主菌为大肠杆菌BL21(DE3)，表达载体选自pACYCDuet-1、pETuet-1和pCDFDuet-1。


5.根据权利要求1～3任一所述的一种大肠杆菌工程菌，其特征在于，以pACYCDuet-1表达manC-manB，以pETuet-1表达gmd-wcaG，以pCDFDuet-1表达gsk-zwf。


6.根据权利要求1～5任一所述的一种大肠杆菌工程菌，其特征在于，以标准核糖体结合位点和野生型核糖体结合位点替换工程菌中pACYCDuet-1-manC-manB和pETDuet-1-gmd-wcaG质粒本身的核糖体结合位点。


7.一种提高大肠杆菌产GDP-岩藻糖能力的方法，其特征在于，组合调控磷酸甘露糖变位酶ManB、GDP-甘露糖焦磷酸化酶ManC、GDP-甘露糖4,6-脱水酶Gm...

【专利技术属性】
技术研发人员：沐万孟，张文立，万李，朱莺莺，李雯，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32