一株犬种粗糙型布鲁氏菌疫苗株制造技术

本发明专利技术涉及一株犬种粗糙型布鲁氏菌疫苗株。本发明专利技术提供的犬种布鲁氏菌基因缺失重组菌，是将犬种布鲁氏菌菌株(Brucella canis)中的群体感应系统VjbR蛋白编码基因缺失得到的菌株。与出发菌株相比，本发明专利技术得到的菌株的毒力更弱，无需灭活就可以免疫动物，且不引起成年孕犬流产。使用本发明专利技术的菌株免疫小鼠和比格犬，在小鼠和比格犬体内能够产生较好的保护力。鉴于当前即无预防犬种布鲁氏菌的疫苗，也没有治疗犬感染犬种布鲁氏菌的有效药物，本发明专利技术对开发犬种布鲁氏菌基因缺失标记疫苗和配套的鉴别诊断试剂，及对保护人类和犬只健康具有十分重要的意义。

A Brucella vaccine strain of rough type of dog species

【技术实现步骤摘要】
一株犬种粗糙型布鲁氏菌疫苗株
本专利技术涉及一种犬种粗糙型布鲁氏菌基因缺失重组菌的构建及其应用，属于兽用生物制品领域。
技术介绍
布鲁氏菌病(Brucellosis)，简称布病，是由布鲁氏菌属(Brucellaspp.)细菌引起的人畜共患的变态反应性传染病。陆地或海洋中的所有的哺乳动物均容易受到感染，但牛、羊、猪等家畜和野生动物最易感。布鲁氏菌是一种细胞内寄生的病原菌，对人和哺乳动物具有高度感染性和致病性，临床上动物以流产、胎衣不下、睾丸炎、附睾炎、关节炎等为特征。人感染则表现为长期发热、多汗、生殖系统疾病、关节痛、肝脾肿大以及肌肉—骨骼系统和中枢神经系统的严重并发症等，因此成为一个严重的公共卫生安全问题。布鲁氏菌属有9个生物种，即马尔他布鲁氏菌(羊种布鲁氏菌Brucellamelltensis，含3个生物型)、流产布鲁氏菌(牛种布鲁氏菌Brucellaabortus，含8个生物型)、猪种布鲁氏菌(Brucellasuis，含5个生物型)、绵羊附睾种布鲁氏菌(Brucellaovis)、沙林鼠种布鲁氏菌(Brucellaneotormae)、犬种布鲁氏菌(Brucellacanis)、鲸种布鲁氏菌(Brucellaceti)、鳍足种布鲁氏菌(B.pinnipedialis)、田鼠种布鲁氏菌(Brucellamicroti)。临床上以羊种、牛种、猪种3种布鲁氏菌的意义最大，羊种布鲁氏菌的致病力最强。犬是犬种布鲁氏菌的主要宿主，犬感染犬种布鲁氏菌主要引起生殖系统的病变，引起雌犬流产和雄犬不育，还能引起眼炎、椎骨椎间盘炎、淋巴结肿大、脾脏肿大、跛行、背痛、关节疼痛等非生殖系统症状。值得注意的是，当犬携带犬种布鲁氏菌时，可能通过口鼻接触或职业性接触(宠物医生、实验室人员)将犬种布鲁氏菌传播给人类。国际上已有多篇人感染犬种布鲁氏菌的报道。人类感染犬种布鲁菌时，通常呈现出轻微的或无典型的临床症状,表现出头痛、回归热、虚弱、乏力、出汗、体重减轻等症状。根据我国部分城市中犬感染犬种布鲁氏菌的调查结果显示，各地区的犬中普遍存在一定比例的犬种布鲁氏菌感染。鉴于当前即无预防犬种布鲁氏菌的疫苗，也没有治疗犬感染犬种布鲁氏菌的有效药物，因此，研究开发预防犬种布鲁氏菌的疫苗，对保护人类和犬只健康具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是构建一种缺失群体感应系统VjbR蛋白编码基因的重组犬种布鲁氏菌，该重组菌可以用于对犬布病的预防。本专利技术的技术方案1.一株犬种粗糙型布鲁氏菌疫苗株，其特征在于该犬种布鲁氏菌vjbR基因缺失重组菌的构建，是将犬种布鲁氏菌中的群体感应系统VjbR蛋白的编码基因缺失得到的菌株；所述的该菌株的构建是根据犬种布鲁氏菌基因组中的群体感应系统VjbR蛋白编码基因设计两对引物，一对引物用于扩增同源臂DVjbR-1，第二对引物用于扩增DVjbR-2；同源臂DVjbR-1和同源臂DVjbR-2连接后形成序列DVjbR，将序列DVjbR插入pUC19sacB载体，得到最终的重组载体pUC19sacB-DVjbR；重组载体pUC19sacB-DVjbR与犬种布鲁氏菌菌株RM6/66发生同源重组即得到缺失群体感应系统VjbR蛋白编码基因的重组菌株将其命名为犬种布鲁氏菌(Brucellacanis)BCΔvjbR重组菌株，该株重组菌已于2019年10月25日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCCNo.18742。2.本专利技术所述的一株犬种粗糙型布鲁氏菌疫苗株的构建，其特征在于所述该菌群体感应系统VjbR蛋白是由序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质。3.如本专利技术所述的一株犬种粗糙型布鲁氏菌疫苗株，其特征在于其菌株构建中所述缺失是通过同源重组实现的。4.本专利技术所述的一株基因缺失型犬种粗糙型布鲁氏菌疫苗株，其特征在于所述的一种布鲁氏菌疫苗，其生产菌株为权利要求1-3所述的任一种犬种布鲁氏菌的重组菌。5.本专利技术所述的一株犬种粗糙型布鲁氏菌疫苗株，其特征在于该菌株的缺失基因及其衍生物应用于犬种布鲁氏菌病新型诊断试剂中活性成分的制备。本专利技术有益效果本专利技术涉及一株犬种粗糙型布鲁氏菌疫苗株的构建及其应用。本专利技术提供的犬种布鲁氏菌基因缺失重组菌，是将犬种布鲁氏菌菌株(Brucellacanis)中的群体感应系统VjbR蛋白编码基因缺失得到的菌株。与出发菌株相比，本专利技术得到的菌株的毒力更弱，无需灭活就可以免疫动物，且不引起成年母犬流产。使用本专利技术的菌株免疫小鼠和靶动物比格犬，在小鼠和比格犬体内能够产生保护力。本专利技术对犬种布鲁氏菌病疫苗的改造、诊断鉴别试剂的研发，开发布鲁氏菌基因缺失标记疫苗和配套的鉴别诊断试剂，对保护人类和犬只健康具有十分重要的意义。附图说明图1为DVjbR-1和DVjbR-2的PCR扩增电泳图图中M：Marker50001:DVjbR-12:DVjbR-2。图2为DVjbR的PCR扩增电泳图图中M:Marker50001:DVjbR。图3为pUC19sacB-DVjbR转化大肠杆菌DH5α后经PCR扩增的鉴定图图中M：Marker50001,2,4,6,7：经PCR鉴定为阴性的菌落3,5,8：经PCR鉴定为阳性的菌落。图4为pUC19sacB-DVjbR转化大肠杆菌DH5α后双酶切鉴定图图中M：Marker50001：经双酶切后的阳性质粒。图5为重组菌BCΔvjbR的PCR鉴定图图中M：Marker50001:犬种RM6/66野生型菌株；2：重组菌BCΔvjbR。图6为重组菌BCΔvjbR接种后小鼠脾脏载菌量随时间变化图中图6A亲本菌株犬种RM6/66、重组菌BCΔvjbR和PBS对照组接种小鼠后1周和4周的脾脏重量变化；图6B亲本菌株犬种RM6/66和重组菌BCΔvjbR接种小鼠后1周和4周的脾脏载菌量的变化。图7为重组菌BCΔvjbR接种后比格犬脾脏载菌量随时间变化。图8为重组菌BCΔvjbR接种小鼠的免疫保护效果图中PBS表示阴性对照组，BCΔvjbRH表示高剂量免疫接种BCΔvjbR产生的免疫保护力，BCΔvjbRL表示低剂量免疫接种重组菌BCΔvjbR产生的免疫保护力。图9为重组菌BCΔvjbR接种比格犬的免疫保护效果图中BCΔvjbR为免疫组犬攻毒后脾脏的载度量，PBS表示阴性对照组。本专利技术涉及微生物资源信息本专利技术所涉及的犬种布鲁氏菌(Brucellacanis)RM6/66株取自中国兽医药品监察所；本专利技术构建的犬种布鲁氏菌vjbR基因缺失重组菌被命名为犬种布鲁氏菌(Brucellacanis)BCΔvjbR重组菌株，该株重组菌拟于2019年10月25日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCCNo.18742。具体实施方式1.犬种布鲁氏菌基因缺失重组菌的构建该本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一株犬种粗糙型布鲁氏菌疫苗株，其特征在于该犬种布鲁氏菌vjbR基因缺失重组菌的构建，是将犬种布鲁氏菌中的群体感应系统VjbR蛋白的编码基因缺失得到的菌株；/n所述的该菌株的构建是根据犬种布鲁氏菌基因组中的群体感应系统VjbR蛋白编码基因设计两对引物，一对引物用于扩增同源臂DVjbR-1，第二对引物用于扩增DVjbR-2；同源臂DVjbR-1和同源臂DVjbR-2连接后形成序列DVjbR，将序列DVjbR插入pUC19sacB载体，得到最终的重组载体pUC19sacB-DVjbR；重组载体pUC19sacB-DVjbR与犬种布鲁氏菌RM6/66株菌发生同源重组，即得到缺失群体感应系统VjbR蛋白编码基因的重组菌株将其命名为犬种布鲁氏菌(Brucella canis)BCΔvjbR重组菌株，该株重组菌拟于2019年10月25日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCC No.18742。/n

【技术特征摘要】
1.一株犬种粗糙型布鲁氏菌疫苗株，其特征在于该犬种布鲁氏菌vjbR基因缺失重组菌的构建，是将犬种布鲁氏菌中的群体感应系统VjbR蛋白的编码基因缺失得到的菌株；
所述的该菌株的构建是根据犬种布鲁氏菌基因组中的群体感应系统VjbR蛋白编码基因设计两对引物，一对引物用于扩增同源臂DVjbR-1，第二对引物用于扩增DVjbR-2；同源臂DVjbR-1和同源臂DVjbR-2连接后形成序列DVjbR，将序列DVjbR插入pUC19sacB载体，得到最终的重组载体pUC19sacB-DVjbR；重组载体pUC19sacB-DVjbR与犬种布鲁氏菌RM6/66株菌发生同源重组，即得到缺失群体感应系统VjbR蛋白编码基因的重组菌株将其命名为犬种布鲁氏菌(Brucellacanis)BCΔvjbR重组菌株，该株重组菌拟于2019年1...

【专利技术属性】
技术研发人员：彭小薇，丁家波，刘郁夫，孙佳丽，蒋卉，冯宇，许冠龙，秦玉明，沈青春，
申请(专利权)人：中国兽医药品监察所，
类型：发明
国别省市：北京;11