一种猪卵母细胞体外成熟培养液及其制备方法与应用技术

一种猪卵母细胞体外成熟培养液及其制备方法与应用，属于卵母细胞体外成熟培养技术领域。为了解决目前猪卵母细胞体外成熟率和发育率低的问题，本发明专利技术提供了一种猪卵母细胞体外成熟培养液及其制备方法与应用。本发明专利技术所述的培养液由基础培养液TCM‑199，青霉素，链霉素，NaHCO

A culture medium for in vitro maturation of porcine oocytes and its preparation and Application

【技术实现步骤摘要】
一种猪卵母细胞体外成熟培养液及其制备方法与应用
本专利技术属于卵母细胞体外成熟培养
具体涉及一种猪卵母细胞体外成熟培养液及其制备方法与应用。
技术介绍
现代生物学和生物医学研究表明猪的生物学特性和遗传特性与人类具有相当高的同源性，被认为是人体异种器官来源的首选动物，因此猪在生物医学研究中是重要的模式动物。体外培养技术和当今飞速发展的基因编辑技术的有效结合，不仅促进了胚胎工程的发展及应用，而且带动了医学领域的发展。卵母细胞体外成熟(IVM)是胚胎体外生产(IVP)的重要一环，如今对猪卵母细胞体外成熟培养(IVM)的标准也在不断的提升。尽管现在猪的卵母细胞IVM体系得到了很大的改善，但是猪卵母细胞体外成熟率仍然低于体内。随着动物胚胎工程的发展，科研和生产方面对于卵母细胞的需求越来越大。传统的超数排卵获得成熟的卵母细胞已远远满足不了当前对卵母细胞的需求，哺乳动物卵母体外成熟一直是研究卵母细胞体外培养、体外受精和胚胎发育等关键步骤，也一直是研究热点和难点。与卵母细胞体内成熟相比，卵母细胞体外成熟存在细胞核和细胞质成熟不协调、不同步问题，这直接导致卵子发育潜力受阻，表现为体外受精胚胎发育率低和胚胎质量差等，表明卵母细胞体外成熟培养系统与受精率和囊胚发育率有较强的相关性。所以深入探索卵母细胞的成熟规律，改善卵母细胞体外成熟的培养环境，建立一种完善的卵母细胞体外成熟体系，是当前胚胎工程研究的重要内容之一。
技术实现思路
为了解决目前猪卵母细胞体外成熟率和发育率低的问题，本专利技术提供了一种猪卵母细胞体外成熟培养液及其制备方法与应用。本专利技术所述的猪卵母细胞体外成熟培养液，含有单宁酸。优选的，所述卵母细胞体外成熟培养液，由基础培养液TCM-199，青霉素，链霉素，NaHCO3，4-羟乙基哌嗪乙磺酸Hepes，聚乙烯醇，丙酮酸钠，胰岛素，半胱氨酸，表皮生长因子，猪卵泡液，孕马血清促性腺激素PMSG，人绒毛膜促性腺激素hCG和单宁酸组成。优选的，所述卵母细胞体外成熟培养液，以TCM-199为基准计，青霉素的质量浓度为0.048-0.066g/L，链霉素的质量浓度为0.08-0.12g/L，NaHCO3的浓度为1.95-2mmol/L，Hepes的浓度为9.5-10mmol/L，聚乙烯醇的质量浓度为2.5-3.5g/L，丙酮酸钠的浓度为0.9-0.95mmol/L，胰岛素的质量浓度为8-12ng/mL，半胱氨酸的浓度为0.5-0.7mmol/L，表皮生长因子的质量浓度为8-12ng/mL，猪卵泡液体积浓度为75-125mL/L，PMSG的浓度为8-12IU/mL，hCG的浓度为8-12IU/mL，单宁酸的浓度为1-50μg/mL。优选的，所述卵母细胞体外成熟培养液，以TCM-199为基准计，青霉素的质量浓度为0.06g/L，链霉素的质量浓度为0.1g/L，NaHCO3的浓度为1.99mmol/L，Hepes的浓度为9.8mmol/L，聚乙烯醇的质量浓度为3g/L，丙酮酸钠的浓度为0.91mmol/L，胰岛素的质量浓度为10ng/mL，半胱氨酸的浓度为0.6mmol/L，表皮生长因子的质量浓度为10ng/mL，猪卵泡液体积浓度为100mL/L，PMSG的浓度为10IU/mL，hCG的浓度为10IU/mL，单宁酸的浓度为10μg/mL。本专利技术还提供了所述的猪卵母细胞体外成熟培养液的制备方法，具体步骤如下：(1)猪卵泡液的获取：从猪卵巢的卵泡中抽出液体，对所述液体进行离心，保留上清液，对上清液进行过滤除杂，获得所需要的猪卵泡液；(2)将TCM-199，青霉素，链霉素，NaHCO3，Hepes，聚乙烯醇，丙酮酸钠，胰岛素，半胱氨酸，表皮生长因子，PMSG，hCG，单宁酸和步骤(1)所获得的猪卵泡液混合，获得培养液粗液。(3)对步骤(2)所获得的培养液粗液过滤除菌，获得所述的猪卵母细胞体外成熟培养液。优选的，步骤(1)所述的猪卵巢温度是28-35℃。优选的，步骤(1)所述的离心是4-6℃条件下，12000-14000r/min，离心30-60min。优选的，步骤(1)所述的过滤除杂是用0.45μm的滤器进行过滤。优选的，步骤(3)所述的过滤除菌是用0.22μm的滤器进行过滤。本专利技术还提供了所述的猪卵母细胞体外成熟培养液在体外培养猪卵母细胞上的应用。有益效果本专利技术所述的含有单宁酸的卵母细胞体外成熟培养液，可以提高卵母细胞体外成熟质量；提高卵丘细胞扩散指数；提高孤雌胚胎囊胚率、囊胚总细胞数；提高体外受精胚胎卵裂率、囊胚率以及囊胚总细胞数。具体实施方式本专利技术所有实验试剂均购置于Sigma(美国)公司，特殊说明的除外：TCM-199(Invitrogen)，100XITS-A(Invitrogen)，青霉素(Invitrogen)，链霉素(Invitrogen)，单宁酸(APExBIO)，PZM-5(FunakoshiCorporation)，H2DCFDA(Invitrogen)，CellTrackerBlueCMF2HC(Invitrogen)。本专利技术所述的卵母细胞体外成熟培养液，由基础培养液TCM-199，青霉素，链霉素，NaHCO3，4-羟乙基哌嗪乙磺酸(Hepes)，聚乙烯醇，丙酮酸钠，胰岛素，半胱氨酸，表皮生长因子，猪卵泡液，孕马血清促性腺激素(PMSG)，人绒毛膜促性腺激素(hCG)和单宁酸组成。下面结合具体实施例对本专利技术做进一步说明，但本专利技术不受实施例的限制。实施例1.卵母细胞体外成熟培养液。本实施例所述的卵母细胞体外成熟培养液具体成分如下：以TCM-199为基准计，青霉素的质量浓度为0.048g/L，链霉素的质量浓度为0.12g/L，NaHCO3的浓度为1.95mmol/L，Hepes的浓度为10mmol/L，聚乙烯醇的质量浓度为2.5g/L，丙酮酸钠的浓度为0.95mmol/L，胰岛素的质量浓度为12ng/mL，半胱氨酸的浓度为0.5mmol/L，表皮生长因子的质量浓度为8ng/mL，猪卵泡液体积浓度为125mL/L，PMSG的浓度为12IU/mL，hCG的浓度为8IU/mL，单宁酸的浓度为1μg/mL。本实施例所述的猪卵母细胞体外成熟培养液的制备方法，具体步骤如下：(1)猪卵泡液的获取：从30℃猪卵巢的卵泡中抽出液体，对所述液体进行4℃条件下，12000r/min，离心40min，保留上清液，对上清液用0.45μm的滤器进行过滤除杂，获得所需要的猪卵泡液；(2)将TCM-199，青霉素，链霉素，NaHCO3，Hepes，聚乙烯醇，丙酮酸钠，胰岛素，半胱氨酸，表皮生长因子，PMSG，hCG，单宁酸和步骤(1)所获得的猪卵泡液混合，获得培养液粗液。(3)对步骤(2)所获得的培养液粗液用0.22μm的滤器进行过滤除菌，获得所述的猪卵母细胞体外成熟培养液。实施例2.卵母细胞体外成熟培养液。本实施例所述的卵母细胞体外成熟培本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种猪卵母细胞体外成熟培养液，其特征在于，所述猪卵母细胞体外成熟培养液含有单宁酸。/n

【技术特征摘要】
1.一种猪卵母细胞体外成熟培养液，其特征在于，所述猪卵母细胞体外成熟培养液含有单宁酸。


2.根据权利要求1所述的猪卵母细胞体外成熟培养液，其特征在于，所述培养液由基础培养液TCM-199，青霉素，链霉素，NaHCO3，4-羟乙基哌嗪乙磺酸Hepes，聚乙烯醇，丙酮酸钠，胰岛素，半胱氨酸，表皮生长因子，猪卵泡液，孕马血清促性腺激素PMSG，人绒毛膜促性腺激素hCG和单宁酸组成。


3.根据权利要求2所述的猪卵母细胞体外成熟培养液，其特征在于，所述卵母细胞体外成熟培养液，以TCM-199为基准计，青霉素的质量浓度为0.048-0.066g/L，链霉素的质量浓度为0.08-0.12g/L，NaHCO3的浓度为1.95-2mmol/L，Hepes的浓度为9.5-10mmol/L，聚乙烯醇的质量浓度为2.5-3.5g/L，丙酮酸钠的浓度为0.9-0.95mmol/L，胰岛素的质量浓度为8-12ng/mL，半胱氨酸的浓度为0.5-0.7mmol/L，表皮生长因子的质量浓度为8-12ng/mL，猪卵泡液体积浓度为75-125mL/L，PMSG的浓度为8-12IU/mL，hCG的浓度为8-12IU/mL，单宁酸的浓度为1-50μg/mL。


4.根据权利要求3所述的猪卵母细胞体外成熟培养液，其特征在于，所述卵母细胞体外成熟培养液，以TCM-199为基准计，青霉素的质量浓度为0.06g/L，链霉素的质量浓度为0.1g/L，NaHCO3的浓度为1.99mmol/L，Hepes的浓度为9.8mmol/L，聚乙烯醇的质量浓度为3g/L，丙酮酸钠的浓度为0....

【专利技术属性】
技术研发人员：刘忠华，金君学，孙婧陶，姜超前，王传玥，张弛，
申请(专利权)人：东北农业大学，
类型：发明
国别省市：黑龙;23