一种电感受态细胞的制备方法技术

本发明专利技术适用细菌分子遗传学技术领域，提供一种电感受态细胞的制备方法，包括：将菌种活化后，在培养基中进行8~24h培养；将所述菌种转接到预备含有所述培养基的发酵罐中，培养至OD值不低于2；将所述发酵罐中的菌液进行10~60min低温处理；将所述菌液转移到离心杯中，于温度为3~5℃、3000~8000rpm转速下离心，并倾去上清液；将沉淀重悬于冰预冷的溶液中，于温度为3~5℃、3000~8000rpm转速下离心，并倾去上清液，重复3~8次后，即得。本发明专利技术通过发酵罐中初始培养基体积的提高，带来的高密度培养环境，使细胞总数轻易的提高50倍以上，转化效率可达10

A preparation method of inductive receiving cells

【技术实现步骤摘要】
一种电感受态细胞的制备方法
本专利技术属于细菌分子遗传学
，尤其涉及一种电感受态细胞的制备方法。
技术介绍
使带有遗传信息的DNA分子进入宿主细胞的过程即所谓的“转化”。而用理化方法诱导细胞，使其处于最适摄取和容纳外来DNA的生理状态，即称为“感受态细胞”。在分子生物学领域、遗产工程、基因工程的基本实验中，为了使宿主细胞进行特定的DNA或蛋白质的复制或表达，获得易于转化且高转化效率的感受态细胞成了不可或缺的步骤。非感受态细胞可以通过化学方法或者电穿孔而成为感受态以获取外源基因。例如，大肠杆菌可以在冰浴下通过二价阳离子Ca清洗而成为感受态的。相比之下，电穿孔是向细胞施加电场脉冲以引起细胞膜的结构重组，高电压引起细胞膜瞬时通透，从而允许外源基因进入细胞，转化率最高能达到109-1010转化子/ug闭环DNA。在传统的制备方法中，一般以摇瓶的方法制备感受态细胞，且在OD600较低(0.4左右)的时候收集，通常在一个装液量为200mL的摇瓶，最后仅可以制备成最多1mL的电感受态细胞，制备效率较低；比如传统的大肠杆菌感受态细胞制备量仍然停留在实验室级别，用摇瓶培养，其细胞的总获取量非常有限，所以当用量大时，需要经常制备，造成大量人力物力的消耗。现有的电感受态细胞的制备方法存在产量低、耗时长以及造成大量人力物力的消耗问题。
技术实现思路
本专利技术实施例提供一种电感受态细胞的制备方法，旨在解决现有的电感受态细胞的制备方法存在产量低、耗时长以及造成大量人力物力的消耗问题。本专利技术实施例是这样实现的，一种电感受态细胞的制备方法，包括：将菌种活化后，在培养基中进行8～24h培养；将所述菌种转接到预备含有所述培养基的发酵罐中，培养至OD值不低于2；将所述发酵罐中的菌液进行10～60min低温处理；将所述菌液转移到离心杯中，于温度为3～5℃、3000～8000rpm转速下离心，并倾去上清液；将沉淀重悬于预冷的溶液中，于温度为3～5℃、3000～8000rpm转速下离心，并倾去上清液，重复3～8次后，即得。本专利技术实施例提供的电感受态细胞的制备方法，创新性利用发酵罐培养大肠杆菌细胞，使大肠杆菌在短时间内得以迅速生长、繁殖，可在较高的OD600下收集，是传统方法的5倍以上；即通过发酵罐中初始培养基体积的提高，带来的高密度培养环境，可一次获取大量的细胞，较比传统的摇瓶在细胞培养的效率上获得了大幅的提升，使细胞总数轻易的提高50倍以上，转化效率可达109-1010转化子/ug闭环DNA，使电感受态细胞的产业化发展成为可能，并显著降低了成本。具体实施方式为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。本专利技术实施例提供的电感受态细胞的制备方法，创新性利用发酵罐放大培养大肠杆菌细胞，使大肠杆菌在短时间内得以迅速生长、繁殖，可在较高的OD600下收集，是传统方法的5倍以上；即通过发酵罐中初始培养基体积的提高(10倍以上)，带来的高密度培养环境，可一次获取大量的细胞，较比传统的摇瓶在细胞培养的效率上获得了大幅的提升，使细胞总数轻易的提高50倍以上，转化效率可达109-1010转化子/ug闭环DNA，使电感受态细胞的产业化发展成为可能，并显著降低了成本。值得注意的是，发酵罐通常为发酵菌体，以获得代谢产物所用。本专利技术实施例创新性利用发酵罐放大培养大肠杆菌细胞，可在较高的OD下收集菌体，有效提高感受态的制备效率，并且在提高制备效率的同时，仍然达到较高转化效率。在本专利技术实施例中，该电感受态细胞的制备方法，包括以下步骤：将菌种活化后，在培养基中进行8～24h培养；将所述菌种转接到预备含有所述培养基的发酵罐中，培养至OD值不低于2；将所述发酵罐中的菌液进行10～60min低温处理；将所述菌液转移到离心杯中，于温度为3～5℃、3000～8000rpm转速下离心，并倾去上清液；将沉淀重悬于预冷的溶液中，于温度为3～5℃、3000～8000rpm转速下离心，并倾去上清液，重复3～8次后，即得。其中，所述培养基为LB培养基、TB培养基、2×YT培养基中的一种。其中，所述LB培养基的制备方法包括：将0.08～0.12g胰蛋白胨、0.05～0.07g酵母粉、0.08～0.12g氯化钠溶于8～12mL去离子水中，并装于离心管内，进行117～125℃灭菌15～25min，即得。其中，所述预备含有所述培养基的发酵罐，具体为：将4～6g胰蛋白胨、2～3g酵母粉、4～6g氯化钠溶于450～550mL去离子水中，并装于发酵罐内；在所述发酵罐中插入pH电极与溶氧电极；将所述发酵罐放入灭菌篮中，进行117～125℃灭菌25～35min；灭菌完成后，将所述发酵罐迅速放入底座，接上通气，通气值为0.3～0.5L/min，安装尾气半导体冷凝装置，DO电极，搅拌电机，插入温度电极，即得。其中，所述低温处理为冰浴、冰水浴、冰盐浴等处理手段中的一种。其中，所述溶液为浓度10％～25％的甘油、浓度5％～15％的DMSO中的一种。其中，所述菌种为大肠杆菌BL21(DE3)菌株。在本专利技术实施例中，所述发酵罐为市面上购买所得，为迪比尔T&J-Minskid1L*4。在本专利技术一个优选实施例中，上述将菌种活化后，在培养基中进行8～24h培养的步骤，具体包括：在紫外灭菌20～40min后的超净台内，取出-80℃保存的菌种，并解冻；用接种环挑取单克隆的菌种到培养基中，于温度为35～39℃下，200～300rpm摇床中培养过夜，培养时间为16～18h。在本专利技术一个优选实施例中，上述将所述菌种转接到预备含有所述培养基的发酵罐中，培养至OD值不低于2的步骤，具体包括：在超净工作台中，以无菌针管吸取菌种；在对所述无菌针管的针头进行酒精消毒后，通过预备含有所述培养基的发酵罐上端接种口将菌种垂直打入；对所述发酵罐的发酵参数进行设置，于温度为35～39℃下培养3～5h。其中，所述发酵参数包括转速参数、通气参数；其中，所述转速参数设定为：DO40％、最大转数1300rmp、最小转数200rmp、加减步值50rmp以及周期60s；所述通气参数设定为：最大流量4L/h、最小流量0.2L/h、加减步值0.2L/h以及周期60s。本专利技术实施例还对上述获得的电感受态细胞进行转化率的验证，方案具体为：取上述电感受态80uL置于电转杯中，加入一定量的质粒，点击转化，计算转化率。以下通过具体实施例对本专利技术的电感受态细胞的制备方法的技术效果做进一步的说明。实施例1准备工作：LB培养基配备：0.1g胰蛋白胨、0.05g酵母粉、0.1g氯化钠溶于10mL去离子水中，并装于50mL离心管，121℃灭菌20mi本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种电感受态细胞的制备方法，其特征在于，包括：/n将菌种活化后，在培养基中进行8~24h培养；/n将所述菌种转接到预备含有所述培养基的发酵罐中，培养至OD值不低于2；/n将所述发酵罐中的菌液进行10~60min低温处理；/n将所述菌液转移到离心杯中，于温度为3~5℃、3000~8000rpm转速下离心，并倾去上清液；/n将沉淀重悬于预冷的溶液中，于温度为3~5℃、3000~8000rpm转速下离心，并倾去上清液，重复3~8次后，即得。/n

【技术特征摘要】
1.一种电感受态细胞的制备方法，其特征在于，包括：
将菌种活化后，在培养基中进行8~24h培养；
将所述菌种转接到预备含有所述培养基的发酵罐中，培养至OD值不低于2；
将所述发酵罐中的菌液进行10~60min低温处理；
将所述菌液转移到离心杯中，于温度为3~5℃、3000~8000rpm转速下离心，并倾去上清液；
将沉淀重悬于预冷的溶液中，于温度为3~5℃、3000~8000rpm转速下离心，并倾去上清液，重复3~8次后，即得。


2.根据权利要求1所述的电感受态细胞的制备方法，其特征在于，所述将菌种活化后，在培养基中进行8~24h培养的步骤，具体包括：
在紫外灭菌20~40min后的超净台内，取出-80℃保存的菌种，并解冻；
用接种环挑取单克隆的菌种到培养基中，于温度为35~39℃下，200~300rpm摇床中培养过夜，培养时间为16~18h。


3.根据权利要求1所述的电感受态细胞的制备方法，其特征在于，所述培养基为LB培养基、TB培养基、2×YT培养基中的一种。


4.根据权利要求3所述的电感受态细胞的制备方法，其特征在于，所述LB培养基的制备方法包括：
将0.08~0.12g胰蛋白胨、0.05~0.07g酵母粉、0.08~0.12g氯化钠溶于8~12mL去离子水中，并装于离心管内，进行117~125℃灭菌15~25min，即得。


5.根据权利要求1所述的电感受态细胞的制备方法，其特征在于，所述预备含有所述培养基的发酵罐，具体为：
将4~6g胰蛋...

【专利技术属性】
技术研发人员：周丽，何晨丹，孙磊，曹雪晨，
申请(专利权)人：宁波酶赛生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33