本发明专利技术提供了一种生产2’‑岩藻糖基乳糖的大肠杆菌工程菌株，通过CRISPR/Cas9基因编辑系统，敲除原始菌株2’‑岩藻糖基乳糖合成代谢途径中的相关基因；构建模块化代谢通路，通过不同质粒组合调控代谢途径中的磷酸甘露糖变位酶(ManB)，甘露糖‑1‑磷酸鸟嘌呤基转移酶(ManC)，GDP‑甘露糖‑6‑脱氢酶(Gmd)，GDP‑岩藻糖合成酶(WcaG)，L‑岩藻糖1‑激酶/GDP‑岩藻糖焦磷酸化酶(Fkp)以及2’‑岩藻糖基乳糖合成酶(FucT2)的表达水平，使细胞内能积累更高浓度的2’‑岩藻糖基乳糖。本发明专利技术还提供了一种高效生产2’‑岩藻糖基乳糖的方法。
An engineering strain of Escherichia coli producing 2 '- fucosyllactose
【技术实现步骤摘要】
一种生产2’-岩藻糖基乳糖的大肠杆菌工程菌株
本专利技术涉及一种生产2’-岩藻糖基乳糖的大肠杆菌工程菌株，属于微生物基因工程领域。
技术介绍
母乳通常被认为是提供婴儿营养的最重要的来源。作为母乳中的含量第三的固体组分，对于婴幼儿肠道菌群的发育以及预防病原菌与上皮细胞的粘附，人乳寡糖的合成发挥着重要的作用。岩藻糖基化乳糖，包括2’-岩藻糖基乳糖、3’-岩藻糖基乳糖、乳酰-N-岩藻五糖等，能选择性地刺激双歧杆菌的生长并形成致病菌受体的类似物，从而保护婴儿防止肠道病原体的感染，如肠道病原体，大肠杆菌、霍乱弧菌和沙门氏菌。2’-岩藻糖基乳糖作为人乳寡糖中含量最高的成分，受到广泛关注，具备应用于婴幼儿产品的广泛前景。相比于酶法和化学法，以微生物发酵法合成2’-岩藻糖基乳糖更加高效和安全。目前微生物发酵法发酵法生产2’-岩藻糖基乳糖主要有两个代谢通路，分别是从头合成途径和补救途径。从头合成途径主要是通过将磷酸甘露糖变位酶(ManB)，甘露糖-1-磷酸鸟嘌呤基转移酶(ManC)，GDP-甘露糖-6-脱氢酶(Gmd),GDP-岩藻糖合成酶(WcaG)中的一个或多个基因在大肠杆菌中过表达，或者通过补救合成途径，过表达L-岩藻糖1-激酶/GDP-岩藻糖焦磷酸化酶(Fkp)和2’-岩藻糖基乳糖合成酶(FucT2)；Lee等将从头合成途径的ManB、ManC、Gmd、WcaG以及FucT2共表达于失去β-半乳糖糖苷酶活性的E.coliJM109，提高了乳糖利用率，2’-岩藻糖基乳糖的摇瓶发酵产量最终达到了1.25g/L。但E.coliJM109菌株在发酵过程中形成的生物膜可带来很多严重的后果，难以应用于高密度发酵。还有报道通过基因整合的方式将GDP-岩藻糖从头合成途径的关键基因以及FucT2整合到E.coliJM109染色体组上，避免了抗生素的食品安全问题，在无抗生素的13L补料发酵中，得到了20.28g/L的产量。但相对与传统的质粒表达，基因整合的过程较为复杂，基因的表达水平较低。此外，Chin等构建了2’-岩藻糖基乳糖生产的补救途径，敲除大肠杆菌中代谢乳糖的lacZ基因，2’-岩藻糖基乳糖的产率提高了4.3倍；同时又敲除代谢岩藻糖的fucIK基因簇，使2’-岩藻糖基乳糖的产量得到进一步提高，摇瓶发酵产量达到2.1g/L。尽管2’-岩藻糖基乳糖的产量得到显著提高，但用于其生产的L-岩藻糖价格昂贵,2’-岩藻糖基乳糖的产率也较低(67.7％)，较难应用于大规模的发酵生产。
技术实现思路
针对现有的技术难点及存在的问题，本专利技术提供了一种高效生产2’-岩藻糖基乳糖的大肠杆菌工程菌及其构建方法。本专利技术的第一个目的是提供一种高效生产2’-岩藻糖基乳糖的大肠杆菌工程菌，所述大肠杆菌工程菌组合调控磷酸甘露糖变位酶ManB，甘露糖-1-磷酸鸟嘌呤基转移酶ManC，GDP-甘露糖-6-脱氢酶Gmd，GDP-岩藻糖合成酶WcaG、L-岩藻糖1-激酶/GDP-岩藻糖焦磷酸化酶Fkp以及2-岩藻糖基乳糖合成酶FucT2的表达。在本专利技术的一种实施例中，所述大肠杆菌工程菌还敲除了β-半乳糖苷酶LacZ、UDP-葡萄糖脂质载体转移酶WcaJ、岩藻糖异构酶/墨角藻糖激酶FucI-FucK基因簇。在本专利技术的一种实施方式中，所述大肠杆菌工程菌的宿主菌为大肠杆菌BL21(DE3)，表达载体为pETuet-1和pCDFDuet-1。在本专利技术的一种实施方式中，所述大肠杆菌工程菌以pCDFDuet-1表达manC-manB和gmd-wacG，以pETuet-1表达fkp和fucT2。在本专利技术的一种实施方式中，ManB、ManC、Gmd、WcaG的基因来源于大肠杆菌K-12(Escherichiacolik-12)，核苷酸序列依次如SEQIDNO.1～4所示。在本专利技术的一种实施方式中，Fkp和FucT2的基因分别来源于脆弱拟杆菌(Bacteroidesfragilis)9343和幽门螺杆菌(Helicobacterpylori)，核苷酸序列依次为SEQIDNO.5、SEQIDNO.6所示。本专利技术的第二个目的是提供一种提高大肠杆菌产2’-岩藻糖基乳糖能力的方法，其特征在于，组合调控ManB、ManC、Gmd、WcaG、Fkp以及FucT2的表达。所述调控表达是采用中拷贝表达元件调控ManB、ManC、Gmd、WcaG的表达，采用高拷贝表达元件调控Fkp和FucT2的表达。本专利技术的第三个目的是提供一种高效生产2’-岩藻糖基乳糖的大肠杆菌工程菌的构建方法，包括如下步骤：(1)采用CRISPR/Cas9基因编辑系统分别构建敲除了wacJ基因、wacJ和lacZ基因、wacJ，lacZ和fucIK基因的大肠杆菌BL21(DE3)工程菌；(2)分别以pETDuet-1，pCDFDuet-1和pACYCDuet-1为表达载体，构建过表达ManB-ManC-Gmd-WcaG和Fkp-FucT2的重组表达载体；(3)将pACYCDuet-1-ManB-ManC-Gmd-WcaG和pETDuet-1-Fkp-FucT2同时转化敲除了wacJ基因、wacJ和lacZ基因、wacJ，lacZ和fucIK基因的大肠杆菌BL21(DE3)工程菌，筛选出具有最高2’-岩藻糖基乳糖产量的敲除基因宿主菌株；(4)以筛选出的具有最高2’-岩藻糖基乳糖产量的，敲除了wacJ，lacZ和fucIK基因的大肠杆菌BL21(DE3)为宿主，将步骤(2)中构建的重组表达载体导入宿主菌中，筛选出具有最高2’-岩藻糖基乳糖产量的重组质粒组合。本专利技术的第四个目的是提供一种高效生产2’-岩藻糖基乳糖的大肠杆菌工程菌的发酵方法，是以所述基因工程菌为发酵微生物，以乳糖和L-岩藻糖为底物，以甘油或葡萄糖作为碳源合成2’-岩藻糖基乳糖。本专利技术还要求保护所述工程菌在制备2’-岩藻糖基乳糖及其衍生产品中的应用。本专利技术的有益效果：本专利技术通过敲除大肠杆菌宿主2’-岩藻糖基乳糖合成途径中LacZ、WcaJ和FucIK的表达，并组合调控2’-岩藻糖基乳糖头合成途径中ManB、ManC、Gmd、WcaG、Fkp和FucT2的表达，从而精确调控代谢通路的碳通量，缓解代谢压力，提高2’-岩藻糖基乳糖的产量，将大肠杆菌生产2’-岩藻糖基乳糖的能力由0.22g/L提升至3.81g/L，与现有技术中2.1g/L的2’-岩藻糖基乳糖产量相比，本专利技术2’-岩藻糖基乳糖的产量提高至现有技术的1.81倍，具备工业应用的前景。附图说明图1为2’-岩藻糖基乳糖生产的从头合成途径和补救途径；图2为敲除lacZ基因的PCR验证结果；图3为pETDuet-1-ManB-ManC-Gmd-WcaG载体构建图；图4为pCDDuet-1-Fkp-FucT2过表达载体构建图；图5为不同敲除菌株发酵生产2’-岩藻糖基乳糖的产量比较；图6不同质粒组合的工程菌发酵生产2’-岩藻糖基乳糖的产量比较；图7敲本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种高效生产2’-岩藻糖基乳糖的大肠杆菌工程菌，其特征在于，组合调控磷酸甘露糖变位酶ManB，甘露糖-1-磷酸鸟嘌呤基转移酶ManC，GDP-甘露糖-6-脱氢酶Gmd，GDP-岩藻糖合成酶WcaG、L-岩藻糖1-激酶/GDP-岩藻糖焦磷酸化酶Fkp以及2-岩藻糖基乳糖合成酶FucT2的表达；所述调控表达是采用中拷贝表达元件调控ManB、ManC、Gmd、WcaG的表达，采用高拷贝表达元件调控Fkp和FucT2的表达。/n
【技术特征摘要】
1.一种高效生产2’-岩藻糖基乳糖的大肠杆菌工程菌，其特征在于，组合调控磷酸甘露糖变位酶ManB，甘露糖-1-磷酸鸟嘌呤基转移酶ManC，GDP-甘露糖-6-脱氢酶Gmd，GDP-岩藻糖合成酶WcaG、L-岩藻糖1-激酶/GDP-岩藻糖焦磷酸化酶Fkp以及2-岩藻糖基乳糖合成酶FucT2的表达；所述调控表达是采用中拷贝表达元件调控ManB、ManC、Gmd、WcaG的表达，采用高拷贝表达元件调控Fkp和FucT2的表达。
2.根据权利要求1所述的大肠杆菌工程菌，其特征在于，还敲除了β-半乳糖苷酶LacZ、UDP-葡萄糖脂质载体转移酶WcaJ和岩藻糖异构酶/墨角藻糖激酶FucI-FucK基因簇。
3.根据权利要求1或2所述的大肠杆菌工程菌，其特征在于，所述工程菌的宿主菌为大肠杆菌BL21(DE3)。
4.根据权利要求1～3所述的大肠杆菌工程菌，其特征在于，所述工程菌的表达载体为pETuet-1和pCDFDuet-1。
5.根据权利要求1～4所述的大肠杆菌工程菌，其特征在于，以pCDFDuet-1表达manC-manB和gmd-wacG，以pETuet-1表达fkp和fucT2。
6.根据权利要求1～5所述的大肠杆菌工程菌，其特征在于，ManB、ManC、Gmd、WcaG、F...
【专利技术属性】
技术研发人员：沐万孟，张文立，李雯，朱莺莺，万李，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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