本发明专利技术公开了一种用于微波辅助合成尿苷二磷酸葡萄糖的蔗糖合酶突变酶，属于酶工程领域。本发明专利技术提供了一种蔗糖合酶突变体，所述突变体为，将Nitrosospira europaea来源的蔗糖合酶亲本酶的第320位和/或第117位的氨基酸进行突变后得到的。本发明专利技术通过基因工程手段对蔗糖合酶进行改造，得到稳定性提高的突变酶A320Y‑E117R，在微波辅助处理下，可催化UDP‑Glc的快速合成，使生产效率得到提高，满足工业化生产的需求。
1、尿苷二磷酸葡萄糖(udp-glc)是一种活化的单糖，普遍存在于植物、动物和微生物中，在蔗糖、淀粉、糖原及其他寡糖和多糖合成中作葡萄糖基的供体，同时也是合成尿苷二磷酸半乳糖(udp-gal)，尿苷二磷酸葡萄糖醛酸(udp-glca)，尿苷二磷酸木糖(udp-xyl)和尿苷二磷酸阿拉伯糖(udp-ara)的前体。这些核苷酸糖均与糖类的合成密切相关。但udp-glc等核苷酸糖类物质均难以从自然界中获取，且价格较为昂贵，因此化学法和酶法成为人工制备udp-糖的常用手段。化学法合成udp-glc通常需要较为严苛的条件(如低温)以及较长的反应时间，时长一般在12小时以上。
2、酶法合成则因为反应条件更为温和绿色，展示出其工业化应用的潜能。蔗糖合酶(susy,ec 2.4.1.13)是广泛存在于植物中的糖基转移酶，该酶可催化葡萄糖残基在果糖和尿苷二磷酸(udp)之间的可逆转移(蔗糖+udp＝udp-葡萄糖+果糖)，成为酶法合成udp-glc中重要的方法，目前利用蔗糖合酶生产udp-glc最高。
3、微波辐射常被应用于生物催化反应尤其是非水相酶催化反应中，可带来加快反应速度、减少催化剂用量，甚至改变反应选择性等效果，这些有利影响主要由微波带来的“热效应”及“非热效应”引起。然而，对于水相酶催化体系，微波处理带来的“热效应”下很容易导致体系迅速升温，致使酶催化活性的完全损失，因此微波辅助的水相酶催化反应并不常见。
>4、酶的稳定性的提高将更有利于其抵御微波“热效应”带来的温度提升，进而使得微波处理在酶的水相催化中起到充分的促进作用。本专利技术通过提高蔗糖合酶的热稳定性，并联合适当的微波处理，大幅加快了udp-glc的合成速率，有利于udp-glc的快速低成本的生产。
技术实现思路
1、本专利技术提供了一种蔗糖合酶突变体，所述突变体为，将氨基酸序列如seq id no.1所示的蔗糖合酶亲本酶的第320位和/或第117位的氨基酸进行突变后得到的。
2、在本专利技术的一种实施方式中，所述蔗糖合酶亲本酶来源于：nitrosospiraeuropaea；编码所述蔗糖合酶亲本酶的核苷酸序列如seq id no.2所示。
3、在本专利技术的一种实施方式中，所述突变体为，将氨基酸序列如seq id no.1所示的蔗糖合酶的第320位丙氨酸突变为酪氨酸，同时将第117位的谷氨酸突变为精氨酸得到的；命名为a320y/e117r，氨基酸序列如seq id no.3所示。
4、本专利技术还提供了一种编码上述蔗糖合酶突变体的基因。
5、本专利技术还提供了携带上述基因的重组载体。
6、在本专利技术的一种实施方式中，所述重组载体是以pet28a为表达载体。
7、本专利技术还提供了表达上述蔗糖合酶突变体，或携带上述基因，或携带上述重组载体的重组细胞。
8、在本专利技术的一种实施方式中，所述重组细胞是以细菌或真菌为表达宿主。
9、在本专利技术的一种实施方式中，所述重组细胞是以大肠杆菌或枯草芽孢杆菌为表达宿主。
10、本专利技术还提供了一种提高蔗糖合酶热稳定性的方法，所述方法为，将氨基酸序列如seq id no.1所示的蔗糖合酶的第320位丙氨酸突变为酪氨酸，同时将第117位的谷氨酸突变为精氨酸。
11、本专利技术还提供了一种尿苷二磷酸葡萄糖的制备方法，所述方法为，采用上述突变体或上述重组细胞或上述重组细胞表达的重组蔗糖合酶为催化剂，以蔗糖和尿苷二磷酸为底物，反应制备尿苷二磷酸葡萄糖。
12、在本专利技术的一种实施方式中，所述突变体或重组蔗糖合酶的添加量为：2000-3000u/l
13、在本专利技术的一种实施方式中，所述突变体或重组蔗糖合酶的添加量为：3000u/l。
14、在本专利技术的一种实施方式中，反应条件为60-65℃，ph 6.0-6.5，400-700w的微波间隔5min处理3-5s。
15、在本专利技术的一种实施方式中，反应条件为：60℃，ph 6.5，微波间隔5min处理5s(700w)。
16、本专利技术还提供了一种采用微波辅助提高尿苷二磷酸葡萄糖产量的方法，所述方法为，采用上述突变体或上述重组细胞或上述重组细胞表达的重组蔗糖合酶为催化剂，以蔗糖和尿苷二磷酸为底物，反应制备尿苷二磷酸葡萄糖。
17、在本专利技术的一种实施方式中，所述突变体或重组蔗糖合酶的添加量为：2000-3000u/l
18、在本专利技术的一种实施方式中，所述突变体或重组蔗糖合酶的添加量为：3000u/l。
19、在本专利技术的一种实施方式中，反应条件为60-65℃，ph 6.0-6.5，400-700w的微波间隔5min处理3-5s。
20、在本专利技术的一种实施方式中，反应条件为：60℃，ph 6.5，微波间隔5min处理5s(700w)。
21、本专利技术还提供了上述突变体，或上述基因，或上述重组载体，或上述重组细胞，或上述制备方法在制备食品、保健品及化妆品中的应用。
22、有益效果
23、(1)本专利技术通过基因工程手段对蔗糖合酶进行改造，得到稳定性提高的突变酶a320y-e117r(seq id no.1)，在微波辅助处理下，可催化udp-glc的快速合成，使生产效率得到提高，满足工业化生产的需求。
24、(2)突变酶的解链温度tm相对wt提高了10℃，达到62℃。a320y-e117r在60℃下孵育10min以上后酶活仍能保持50％，其半衰期为13min，较wt提高30倍。
25、(3)应用组合突变体a320y-e117r合成udp-glc，辅以非连续微波处理，反应20min后催化得到了210mm udp-glc，是wt的16.8倍，udp-glc的时空产率达到356g/l/h，实现了在高温下，udp-glc的快速合成。
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【技术保护点】
1.一种蔗糖合酶突变体，其特征在于，所述突变体为，将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的蔗糖合酶的第320位丙氨酸突变为酪氨酸，同时将第117位的谷氨酸突变为精氨酸得到的。
2.编码权利要求1所述蔗糖合酶突变体的基因。
3.携带权利要求2所述基因的载体。
4.表达权利要求1所述的蔗糖合酶突变体，或携带权利要求2所述基因，或含有权利要求3所述载体的重组细胞。
5.根据权利要求4所述的重组细胞，其特征在于，所述重组细胞是以细菌或真菌为表达宿主。
6.一种提高蔗糖合酶热稳定性的方法，其特征在于，所述方法为，将氨基酸序列如SEQID NO.1所示的蔗糖合酶的第320位丙氨酸突变为酪氨酸，同时将第117位的谷氨酸突变为精氨酸。
7.一种尿苷二磷酸葡萄糖的制备方法，其特征在于，所述方法为，采用权利要求1所述的突变体或权利要求4或5所述的重组细胞或权利要求4或5所述的重组细胞表达的重组蔗糖合酶为催化剂，以蔗糖和尿苷二磷酸为底物，反应制备尿苷二磷酸葡萄糖。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述突变体或重组蔗糖合酶的添加量为：2000-3000U/L；优选的，反应条件为60-65℃，pH 6.0-6.5，400-700W的微波间隔5min处理3-5s。
9.一种采用微波辅助提高尿苷二磷酸葡萄糖产量的方法，其特征在于，所述方法为，采用权利要求1所述的突变体或权利要求4或5所述的重组细胞或权利要求4或5所述的重组细胞表达的重组蔗糖合酶为催化剂，以蔗糖和尿苷二磷酸为底物，反应制备尿苷二磷酸葡萄糖；反应条件为60-65℃，pH 6.0-6.5，400-700W的微波间隔5min处理3-5s；优选的，所述突变体或重组蔗糖合酶的添加量为：2000-3000U/L。
10.权利要求1所述的突变体，或权利要求2所述的基因，或权利要求3所述的载体，或权利要求4或5所述的重组细胞，或权利要求6～9任一所述的制备方法在制备食品、保健品及化妆品中的应用。
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【技术特征摘要】
1.一种蔗糖合酶突变体，其特征在于，所述突变体为，将氨基酸序列如seq id no.1所示的蔗糖合酶的第320位丙氨酸突变为酪氨酸，同时将第117位的谷氨酸突变为精氨酸得到的。
2.编码权利要求1所述蔗糖合酶突变体的基因。
3.携带权利要求2所述基因的载体。
4.表达权利要求1所述的蔗糖合酶突变体，或携带权利要求2所述基因，或含有权利要求3所述载体的重组细胞。
5.根据权利要求4所述的重组细胞，其特征在于，所述重组细胞是以细菌或真菌为表达宿主。
6.一种提高蔗糖合酶热稳定性的方法，其特征在于，所述方法为，将氨基酸序列如seqid no.1所示的蔗糖合酶的第320位丙氨酸突变为酪氨酸，同时将第117位的谷氨酸突变为精氨酸。
7.一种尿苷二磷酸葡萄糖的制备方法，其特征在于，所述方法为，采用权利要求1所述的突变体或权利要求4或5所述的重组细胞或权利要求4或5所述的重组细胞表达的重组蔗糖合酶为催化剂，以蔗糖...
【专利技术属性】
技术研发人员：范大明，赵丽婷，丁重阳，闫博文，陈磊，徐萌萌，顾正华，石贵阳，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：
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