一种基因工程菌及其制备方法和用途技术

本发明专利技术公开了一种基因工程菌，该基因工程菌是米尔贝霉素A3/A4或5‑酮‑米尔贝霉素A3/A4的生产菌中过表达milR2基因的工程菌。本发明专利技术还公开了一种该基因工程菌的制备方法及其用途。利用本发明专利技术所述基因工程菌，可有效提高米尔贝霉素A3/A4或5‑酮‑米尔贝霉素A3/A4的生产菌产米尔贝霉素A3/A4或5‑酮‑米尔贝霉素A3/A4的产量，成本较低，适于工业化生产。

A genetically engineered bacterium and its preparation and Application

【技术实现步骤摘要】
一种基因工程菌及其制备方法和用途
本专利技术涉及生物工程领域，具体涉及一种基因工程菌及其制备方法和用途。
技术介绍
米尔贝霉素A3/A4属于十六元环大环内酯的聚酮类化合物，分子式为C31H44O7/C32H46O7，其化学结构式如图1所示。米尔贝霉素对昆虫类和寄生虫类具有高效的杀虫活性而对哺乳动物低毒，与其他农药无交互作用，在土壤、水和空气中降解较快，对周围环境友好，因此在农业上主要被用于防治螨虫、蚜虫和粉虱等害虫，且当米尔贝霉素A3和A4的比例为30％∶70％时，杀虫活性最高(张宝新,王相晶,向文胜.米尔贝霉素毒理学研究进展[J].世界农药,2009,4:11-2)。米尔贝霉素是目前最有前途的广谱、高效、新型、抗虫、无交叉抗性并且环保的生物杀虫剂。有专家预测，它可以替代目前使用于作物保护的有机磷、氨基甲酸酯、拟除虫菊酯类及有机氯类化合物。5-酮-米尔贝霉素A3/A4是合成米尔贝霉素A3/A4的前体化合物，其分子式为C31H42O7/C32H44O7，化学结构式如图2中A所示。米尔贝肟(5-oximilbemycin)A3/A4是5-酮-米尔贝霉素A3/A4与羟胺发生肟化反应后的衍生物(反应式如图2所示)，其活性比例为20％∶80％(徐倩倩,李继昌,向文胜等.米尔贝肟的研究进展[J].中国兽药杂志,2009,07:33-6)，分子式为C31H43NO7/C32H45NO7，化学结构式如图2中B所示。米尔贝肟主要用于防治宠物猫犬的体内寄生虫(钩虫、恶丝虫、鞭虫和眼线虫等)和体外寄生虫(疥螨、脂螨、鼻螨和姬螯螨等)，杀虫活性高、毒性低。米尔贝霉素和米尔贝肟已在日本、美国、荷兰以及中国台湾等多个国家和地区注册，但还没有在中国内地注册，其市场前景不可估量。目前，米尔贝霉素主要是通过微生物发酵，然后再从发酵液中分离提取得到，但是其效价比较低，因此该抗生素的市场价格偏高，不利于其大规模应用。虽然传统的诱变筛选方法可以在一定程度上提高其效价，但是其机理并不清楚，不能为下一步的菌种改造提供理性化的思路。米尔贝肟的合成主要依靠两步化学合成法(图3)，先用CrO3将米尔贝霉素A3/A4氧化为5-酮-米尔贝霉素A3/A4，然后再与盐酸羟胺反应生成米尔贝肟。该合成过程不仅转化效率低，而且对环境不友好(重金属污染)。因此，5-酮-米尔贝霉素A3/A4作为化学中间体，提高其效价意义重大。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是为了克服现有技术当中米尔贝霉素A3/A4或5-酮-米尔贝霉素A3/A4的生产菌产生米尔贝霉素A3/A4或5-酮-米尔贝霉素A3/A4产量较低的缺陷，提供了一种基因工程菌及其制备方法和应用。利用本专利技术所述基因工程菌，可有效提高米尔贝霉素A3/A4或5-酮-米尔贝霉素A3/A4的生产菌产生米尔贝霉素A3/A4或5-酮-米尔贝霉素A3/A4的产量，成本较低，适于工业化生产。专利技术人前期通过对米尔贝霉素A3/A4的生产菌的多个调控基因进行大量筛选后，发现敲除milR2基因可以导致其米尔贝霉素A3/A4的产量下降，同时将milR2基因在该菌株中过表达后，可以使其米尔贝霉素A3/A4的产量提高，使用同样的策略在5-酮-米尔贝霉素A3/A4的生产菌中同样可以使5-酮-米尔贝霉素A3/A4的产量提高。为解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案之一为，一种基因工程菌，所述基因工程菌是米尔贝霉素A3/A4或5-酮-米尔贝霉素A3/A4的生产菌中过表达milR2基因的工程菌。本专利技术中，过表达是指将目的基因的序列与骨架质粒构建成质粒载体，通过转化，获得该基因产物大量积累的生物体。基因过表达的作用主要与基因本身编码蛋白的功能有关。一般来讲，过表达会导致该蛋白的含量增高，如果在细菌中过表达，有利于批量生产。较佳地，所述米尔贝霉素A3/A4或5-酮-米尔贝霉素A3/A4的生产菌为吸水链霉菌(Streptomyceshygroscopicus)；更佳地，所述米尔贝霉素A3/A4的生产菌为吸水链霉菌NRRL5739，所述5-酮-米尔贝霉素A3/A4的生产菌为对吸水链霉菌NRRL5739的milF基因进行敲除后的菌株；其中，milF基因的敲除阻断了将5-酮-米尔贝霉素A3/A4还原为米尔贝霉素A3/A4，5-酮-米尔贝霉素A3/A4是米尔贝霉素A3/A4的上游产物，敲除这个基因中断了所述还原的过程。较佳地，所述基因工程菌携带含有milR2基因的重组表达载体；更佳地，所述重组表达载体的骨架为含有强启动子的质粒；进一步更佳地，所述重组表达载体的骨架为含有红霉素启动子、kasOp*或tipAp的质粒，进一步更佳地，所述重组表达载体的骨架为含有红霉素启动子ermEp*的质粒，优选质粒pIB139。本专利技术中，所述强启动子是指对RNA聚合酶有很高亲和力的启动子，它能指导合成大量的mRNA。本专利技术所述强启动子可以为本专利技术常规的强启动子，包括红霉素启动子和其它链霉菌强启动子例如kasOp*或tipAp等。本专利技术中，所述红霉素启动子包括本领域常规的红霉素启动子，包括ermEp*、ermEp、ermEp1、ermEp2或ermEp1*等。较佳地，所述milR2基因编码的氨基酸序列的NCBI登录号为WP_014173392.1(序列如SEQIDNO.2所示)；更佳地，所述milR2基因的核苷酸序列的GenBank号为CP002047.1(序列如SEQIDNO.1所示)。为解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案之一为，一种制备所述基因工程菌的方法，所述方法包括下列步骤：1)构建milR2基因过表达的重组表达载体；2)将构建的重组表达载体转化到中间宿主菌；3)将带有重组表达载体的中间宿主菌与米尔贝霉素A3/A4或5-酮-米尔贝霉素A3/A4的生产菌进行接合培养。较佳地，所述的中间宿主菌为大肠杆菌S17-1；和/或，所述的接合培养为在M-Isp4培养基培养，培养温度为28℃。所述M-Isp4培养基为本领域常规培养基，较佳地，所述M-Isp4培养基包括以下组分：0.5％黄豆饼粉、0.5％甘露醇、0.5％淀粉、0.2％蛋白胨、0.1％酵母粉、0.1％NaCl、0.2％(NH4)2SO4、0.1％K2HPO3、0.2％CaCO3、2％琼脂粉、0.1％无机盐微量元素溶液；除无机盐微量元素溶液所述百分比为体积比，其余所述百分比为各组分占培养基的质量体积百分比(克/毫升)；更佳地，所述M-Isp4培养基的pH值为7.0。为解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案之一为，一种制备米尔贝霉素A3/A4或5-酮-米尔贝霉素A3/A4的方法，其包括将所述基因工程菌在发酵培养基中进行发酵培养。较佳地，所述发酵培养基包括以下组分：12％蔗糖、1％脱脂奶粉、1％棉籽饼粉、0.1％K2HPO4、0.01％FeSO4·7H2O、0.3％CaCO3；所述百分比为各组分占培养基的质量体积百分比(克/毫升)；更佳地，所述发酵培养基的pH值为7.2，和/或，所述发酵的温度为25～30℃，优选2本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌是米尔贝霉素A3/A4或5-酮-米尔贝霉素A3/A4的生产菌中过表达milR2基因的工程菌；较佳地，所述米尔贝霉素A3/A4或5-酮-米尔贝霉素A3/A4的生产菌为吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)；更佳地，所述米尔贝霉素A3/A4的生产菌为吸水链霉菌NRRL 5739，所述5-酮-米尔贝霉素A3/A4的生产菌为对吸水链霉菌NRRL 5739的milF基因进行敲除后的菌株。/n

【技术特征摘要】
1.一种基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌是米尔贝霉素A3/A4或5-酮-米尔贝霉素A3/A4的生产菌中过表达milR2基因的工程菌；较佳地，所述米尔贝霉素A3/A4或5-酮-米尔贝霉素A3/A4的生产菌为吸水链霉菌(Streptomyceshygroscopicus)；更佳地，所述米尔贝霉素A3/A4的生产菌为吸水链霉菌NRRL5739，所述5-酮-米尔贝霉素A3/A4的生产菌为对吸水链霉菌NRRL5739的milF基因进行敲除后的菌株。


2.如权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌携带含有milR2基因的重组表达载体；较佳地，所述重组表达载体的骨架为含有强启动子的质粒；更佳地，所述重组表达载体的骨架为含有红霉素启动子、kasOp*或tipAp的质粒；进一步更佳地，所述重组表达载体的骨架为含有红霉素启动子ermEp*的质粒，优选质粒pIB139。


3.如权利要求1或2所述的基因工程菌，其特征在于，所述milR2基因编码的氨基酸序列的NCBI登录号为WP_014173392.1；较佳地，所述milR2基因的核苷酸序列的GenBank号为CP002047.1。


4.一种制备如权利要求1～3任一项所述的基因工程菌的方法，其特征在于，所述方法包括下列步骤：
1)构建milR2基因过表达的重组表达载体；
2)将构建的重组表达载体转化到中间宿主菌；
3)将带有重组表达载体的中间宿主菌与米尔贝霉素A3/A4或5-酮-米尔贝霉素A3/A4的生产菌进行接合培养；
较佳地，所述的中间宿主菌为大肠杆菌S17-1；和/或，所述的接合培养为在M-Isp4培养基培养，培养温度为28℃。


5.一种制备米尔贝霉素A3/A4或5-酮-米尔贝霉素A3/A4的方法，其特征在于，包括将如权利要求1～3任一项所述的基因工程菌在发酵培养基中进行发酵培养。


6.如权利要求5所述的制备米尔贝霉素A3/A4或5-酮-米尔贝霉素A3/A4的方法，其特征在于，...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈少欣，姜卫红，芦银华，卫科科，吴远杰，李雷，卫腾云，
申请(专利权)人：上海医药工业研究院，中国科学院上海生命科学研究院，
类型：发明
国别省市：上海;31