本发明专利技术公开了一种促红细胞生成素模拟肽（EMP）与人血清白蛋白HSA的融合蛋白及其制备方法。所述融合蛋白由1个HSA和1个EMP二联体（dEMP）构成，其中HSA位于融合蛋白的N-末端，EMP二联体位于融合蛋白的C-末端，或EMP二联体位于融合蛋白的N-末端，HSA位于融合蛋白的C-末端；在HSA与EMP二联体之间以及两个EMP之间均设有由柔性氨基酸组成的连接肽。所述融合蛋白不仅具有显著促红细胞生成活性，而且具有较长的体内半衰期。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物技术与基因工程制药领域，具体涉及。
技术介绍
红细胞以及由其所产生的血红蛋白在机体生命活动中发挥着重要作用。促红细胞生成素(Erythropoiet in, ΕΡ0)是体内红细胞生成过程中最重要的调控因子,在正常成年人中EPO主要由肾脏产生。慢性肾衰时，肾脏产生EPO相对不足或不能分泌ΕΡ0，从而导致贫血。因此，应用重组人促红细胞生成素(rh-EPO)可以有效治疗肾性贫血。此外，rh-EPO还可用于实体瘤放/化疗所致贫血、外科手术红细胞动员、自体输血等的辅助治疗。 现有的重组EPO类药物，其生产都需要采用哺乳动物细胞系统进行表达和制备，原因是EPO分子必需经过翻译后的糖基化修饰才具有生物活性。与大肠杆菌和酵母表达系统相比，采用哺乳动物细胞表达系统生产目的蛋白的周期相对较长，成本也相对较高。EPO 模拟妝(Erythropoietin mimetic peptide, EMP)是 1996 年 Wrighton 等米用噬菌体展示技术从肽库中筛选出来的一种含有20个氨基酸的多肽，其氨基酸序列与EPO完全不同源，但却能特异性结合EPO受体，尤其是该多肽的二联体能够有效激活EPO受体及相应的细胞内信号通路，从而产生与EPO相似的生物学功能(Wrighton, et al.，Science,1996，273: 458-463)。由于不需要糖基化修饰，所以无论是化学合成，还是通过细菌或酵母表达系统所制备出的EMP 二联体都具有较高的生物活性。然而，EMP的分子量较小，难以通过基因工程技术进行表达与制备，而且由于半衰期短，其体内应用效果也较差。专利技术内容本专利技术的目的在于提供，所述融合蛋白可显著延长EMP 二联体半衰期，具有长效促红细胞生成的特性。本专利技术所述的促红细胞生成素模拟肽与人血清白蛋白HSA的融合蛋白，包含I个人血清白蛋白HSA和I个由两个头尾串联的促红细胞生成素模拟肽EMP组成的EMP 二联体(dEMP)o人血清白蛋白HSA存在天然多态性，本专利技术融合蛋白中的人血清白蛋白HSA也包括这些多态型。优选地,所述促红细胞生成素模拟肽EMP具有SEQ ID NO: I所示的氨基酸序列，或在该氨基酸序列中取代、缺失或插入氨基酸残基所得到的具有所述促红细胞生成素模拟肽EMP活性的氨基酸序列。优选地，所述人血清白蛋白HSA具有SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列，或在该氨基酸序列中取代、缺失或插入氨基酸残基所得到的具有所述人血清白蛋白HSA活性的氨基酸序列。优选地，所述人血清白蛋白HSA位于融合蛋白的N-末端，EMP 二联体位于融合蛋白的C-末端，在人血清白蛋白HSA与EMP 二联体之间以及两个EMP之间均设有连接肽，所述融合蛋白用结构式表示为HSA-dEMP，具体地，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO: 3所示，编码所述融合蛋白的氨基酸序列的DNA序列如SEQ ID N0:5所示。 优选地，所述EMP 二联体位于融合蛋白的N-末端，所述人血清白蛋白HSA位于融合蛋白的C-末端，在人血清白蛋白HSA与EMP 二联体之间以及两个EMP之间均设有连接肽，所述融合蛋白用结构式表示为dEMP- HSA，具体地，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ IDN0:4所示，编码所述融合蛋白的氨基酸序列的DNA序列如SEQ ID N0:6所示。优选地，所述人血清白蛋白HSA与EMP 二联体之间以及两个EMP之间的连接肽均由1-30个氨基酸残基组成。更优选地，所述人血清白蛋白HSA与EMP 二联体之间的连接肽由13个氨基酸残基组成，两个EMP之间的连接肽由4个氨基酸残基组成。更优选地,组成连接肽的氨基酸主要为Gly与Ser、Pro的组合。本专利技术还提供上述融合蛋白的制备方法，主要包含步骤 1)获取编码EMP二联体和连接肽的基因序列，通过限制性内切酶酶切、连接并转化大肠杆菌，将该基因序列克隆至载体质粒I中，获得质粒2 ； 2)以含有HSA的质粒DNA为模版，通过PCR扩增获得两端带有合适限制性内切酶识别位点的HSA的cDNA片段； 3)通过限制性内切酶酶切、连接并转化大肠杆菌，将编码HSA的cDNA片段插入含有EMP 二联体的基因的质粒2中，获得含编码HSA与EMP 二联体的融合蛋白的基因的质粒3 ； 4)通过限制性内切酶酶切、连接并转化大肠杆菌，将编码HSA与EMP二联体的融合蛋白的基因从质粒3亚克隆至表达载体质粒4中，获得含编码HSA与EMP 二联体的融合蛋白的基因的重组表达质粒5 ； 5)将步骤4)所述的重组表达质粒5转化感受态细胞，再转化到宿主表达系统进行表达，即得所述融合蛋白。其中步骤I)的质粒I为可用于基因克隆的常见质粒载体，优选的是PUC57质粒。其中步骤4)的质粒4为可用于重组基因表达的常见质粒载体，优选酵母表达质粒载体，更优选的是PPICZa质粒。其中步骤5)所述宿主是酵母。本专利技术还涉及含有上述融合蛋白的编码基因的重组表达载体。可用于携带编码本专利技术融合蛋白的基因的表达载体包括但不局限于原核、真核表达系统常用的质粒。本专利技术还涉及含有上述重组表达载体的宿主表达系统。宿主可以是细菌、酵母及哺乳动物细胞等，其中优选的是酵母，更优选的是毕赤酵母；对于重组表达的本专利技术融合蛋白可以通过多种方法从相应的细胞培养物中进行提取、纯化，这些方法包括离心、超滤及液相层析等技术，其中液相层析又包括了离子交换、疏水和分子筛等层析技术。人血清白蛋白(HSA)是血浆中的主要蛋白成分，是一种稳定的惰性蛋白，并且具有长达两周以上的血浆半衰期，因此，常被用做药物的载体。HSA由585个氨基酸残基组成，分子量为66. 5kDa,属于非糖基化单链蛋白(A. Dugaiczyk et al. , PNAS, 1982, 79:71-75)。HSA已被成功地在多种宿主中进行表达(EP330451和EP361991 )，尤其是人们已经实现了 HSA在酵母细胞中的高水平稳定表达。HSA在宿主细胞中是以一种原肽形式合成，其中由24个氨基酸残基组成的信号肽和前肽在转运和分泌过程中能够被自动切除。当目的多肽与HSA融合表达时不仅可以提高多肽药物的稳定性，而且还可以增加多肽药物在体内的半衰期。通过与HSA进行融合表达，一些造血生长因子包括EPO、G-CSF、GM-CSF以及干扰素等其它活性因子，都实现了药物作用的长效性(CN1727488A、CN1405181A、CN1405182A)。申请人:通过生物活性测定和代谢动力学分析实验表明，HSA-dEMP可以显著促进红细胞的增殖，而且在体内具有较长的半衰期，说明本专利技术所述融合蛋白保留了 EMP 二联肽的促红细胞增殖活性，并能在体内维持较长时间的发挥作用。因此，本专利技术所述的融合蛋白可用于制备治疗慢性肾功能衰竭导致的贫血、肿瘤化疗导致的贫血、失血后贫血等的药物。本专利技术所述融合蛋白可以与药物载体一起组成药物制剂使用，这些药物载体包括水、盐水、糖类、醇类及氨基酸等。由本专利技术融合蛋白制成的药物制剂优选的是含水量低于3%或不含水的冻干制 剂。这些药物制剂可以用于肾性贫血和其它原因所致贫血的治疗，给药方式包括静脉输注、注射(包括皮下和肌肉注射)、鼻内、呼吸道等，其中优选的是皮下或肌肉注射。本专利技术的本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种促红细胞生成素模拟肽EMP与人血清白蛋白HSA的融合蛋白，其特征在于，包含1个人血清白蛋白HSA和1个由两个头尾串联的促红细胞生成素模拟肽EMP组成的EMP二联体（dEMP）。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：赵景宏，王军平，申明强，聂凌，杨惠标，
申请(专利权)人：中国人民解放军第三军医大学，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。