本发明专利技术涉及一种无糖基化的重组人血清白蛋白-粒细胞集落刺激因子突变体，通过对重组人血清白蛋白粒细胞集落刺激因子基因的潜在糖基化位点进行突变，剔除了重组人血清白蛋白-粒细胞集落刺激因子的潜在糖基化位点，然后转化到毕赤酵母或者酿酒酵母中，发酵纯化，最后得到无糖基化的重组人血清白蛋白-粒细胞集落刺激因子突变体，该突变体克服了原先重组人血清白蛋白-粒细胞集落刺激因子融合蛋白由于糖基化修饰带来的影响药代动力学和免疫反应问题，更适合于用于人体临床研究或治疗应用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因工程领域，具体地说，涉及一种无糖基化的重组人血清白蛋白粒细胞集落刺激因子突变体融合蛋白的构建及其制备方法。
技术介绍
大多数的蛋白药物只能采用皮下注射或静脉注射等方式给药，这类蛋白药物因蛋白酶的作用和肾小球的滤过，在人体内的半衰期比较短，体内清除率高，往往只有几分钟至几小时的半衰期，造成给药频繁，给患者造成诸多困难和不便。此外，其稳定性等也是影响其在体内发挥其功效的因素。因此，如何消除或降低此类蛋白类药物的抗原性、延长其体内半衰期及增加稳定性是生物制药领域的一个热门课题。天然的人粒细胞集落因子(hG-CSF)具有174个氨基酸，若是通过大肠杆菌表达 的重组人粒细胞集落因子(rhG-CSF)因为需要在N-端添加甲硫氨酸而具有175个氨基酸。已上市的重组人粒细胞集落因子注射液药物多为经大肠杆菌表达的175位氨基酸的rhG-CSF,其在肿瘤放疗、化疗引起的粒细胞减少症、再生障碍性贫血、放射病等血液病的治疗及骨髓移植方面具有重要作用，现已应用于临床，是每年销售额最大的几个生物制品药物之一。但是hG-CSF血浆中衰期短，为了达到体内效果一个周期内需要多次给药，这既增加了病人的痛苦，又增加医疗费用，还会引起一些副反应并增加了感染的风险。人血清白蛋白(Human serum albumin, HSA)是人体血清中的主要成分,对维持体内渗透压和血浆体积起着至关重要的作用。人血清白蛋白具有585个氨基酸，是分子量为65kD的非糖基化蛋白，肾清除率非常低，体内半衰期为14 20d。它也是体内因子和药物转运的天然载体。研究表明将治疗性蛋白基因与人血清白蛋白基因融合所表达的融合蛋白可明显降低体内药物的清除速率，延长生物半衰期。Yeh等发现，克鲁维氏酵母表达的HSA-CD4融合蛋白在以家兔为动物模型的实验中半衰期比单独的CD4延长了 140倍。而克鲁维氏酵母表达的HSA-IFNa的融合蛋白(albuferon)在称猴体内的半衰期比单独的IFNa 延长了大约 18 倍(Blaire L.等,TheJournal of Pharmacology And ExperimentalTherapeutics. 2002,303 :540-548)。人血清白蛋白是血液循环中的一个非常重要的天然蛋白，在体液循环中可存在20天以上。研究表明将人粒细胞集落因子与人血清白蛋白基因融合所表达的融合蛋白可明显降低体内药物的清除速率，延长生物半衰期。与人血清白蛋白融合表达的人粒细胞集落因子，即rHSA-hG-CSF有比普通hG-CSF更长的半衰期，从而可以大大减少hG-CSF治疗的给药次数。已有相当多的文献报导了 rHSA-hG-CSF融合蛋白的构建，例如中国专利申请 01124114. 4,02142881. 6,200710020034. 7 和 200810024988. X，美国专利 5876969，wo01/79480,以及非专利文献(W endy Halpern r等，AlbugraninTM,a Recombinant HumanGranulocyte Colony Stimulating Factor(G-CSF)Genetically Fused to RecombinantHuman Albumin Induces ProlongedMyelopoietic, Pharmaceutical Research, Vol.19,No. 11, November2002)。上述文献报道的rHSA-hG-CSF通常利用酵母系统表达，例如毕氏酵母。毕赤酵母是作为外源基因表达系统，具有许多明显优点，其诱导分泌表达的启动子AOXl可用甲醇严格调控，表达产物分泌到上清，不需复杂的破菌手段。而且表达上清的杂蛋白含量很低，有利于进一步的分离纯化。但是毕赤酵母系统会对目标蛋进行糖基化修饰，这种糖基化修饰同哺乳动物的糖基化存在着一些差异，例如毕赤酵母高甘露糖型修饰可能导致药物蛋白代谢动力学性质不良和产生免疫反应，这是限制该类蛋白作为治疗性药物的一个因素。因此，对现有rHSA-hG-CSF融合蛋白进行改造和突变，获得无糖基化位点的rmHSA-hG-CSF,就具有重大的意义。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种无糖基化的重组人血清白蛋白粒细胞集落刺激因子突变体。通过蛋白质糖基化位点预测模拟网站(http://www. cbs. dtu. dk/services/NetOGlyc/)，本申请专利技术人发现，人血清白蛋白(HSA)蛋白序列中上没有糖基化位点，但是 在人粒细胞刺激因子上有一个0-糖基化位点，这个0糖基化位点是位于G-CSF第133位的苏氨酸(Thr)。针对该发现，专利技术人通过大量实验对G-CSF第133位的苏氨酸进行点突变，以期能消除蛋白糖基化问题。最后意外发现，把人粒细胞集落刺激因子上的Thr-133突变成Gly、Ala和Met，经过鉴定，最后得到无糖基化的重组人血清白蛋白粒细胞集落刺激因子突变体(rmHSA-GCSF)，且突变蛋白的生物学活性基本不变。因此，本专利技术首先提供了一种重组人血清白蛋白粒细胞集落刺激因子突变体(rmHSA-GCSF)，所述突变体中的人血清白蛋白的C末端可以直接或通过一柔性的连接肽序列与人粒细胞集落刺激因子的N端相连，或者人粒细胞集落刺激因子的C末端直接或通过一柔性的连接肽序列与人血清白蛋白的N端相连，所述人粒细胞集落刺激因子上第133位的Thr突变成Gly、Ala或Met。上述的重组人血清白蛋白粒细胞集落刺激因子突变体(rmHSA-GCSF)中，所述的人粒细胞集落刺激因子可以是天然G-CSF或天然G-CSF的功能类似物，所述的功能类似物为经过个别氨基酸残基的取代、缺失或增加得到的G-CSF多肽，生物学活性与天然G-CSF基本相同。优选的功能类似物是在天然G-CSF的N端添加甲硫氨酸(Met)，相应的将第134位的Thr突变成Gly、Ala或Met。上述的重组人血清白蛋白-粒细胞集落刺激因子突变体(rmHSA-GCSF)中，柔性连接肽序列通式为 n，n为1_10的整数，优选的是n为1_3的整数，最优选n为I。优选的，上述的重组人血清白蛋白粒细胞集落刺激因子突变体(rmHSA-GCSF)的蛋白序列分别如Seq ID No. I-Seq ID No. 12所示。本专利技术的另一目的是提供编码重组人血清白蛋白粒细胞集落刺激因子突变体(rmHSA-GCSF)的DNA序列，优选的是编码分别如Seq ID No. I-SeqID No. 12所示蛋白序列的DNA序列。通过常规分子生物学实验技术，可将上述的DNA序列连接到合适的表达载体上，得到携带编码本专利技术融合蛋白的DNA序列的重组表达载体。本专利技术的重组表达载体包括pPIC3、pPIC9、pHIL-Dl、pA0804、pA0815、pPSC3K 质粒等。本专利技术的再一个目的是提供表达本专利技术融合蛋白编码基因的宿主。本专利技术的宿主可以是被重组表达载体或重组表达载体的一部分转化，含有本专利技术融合蛋白编码基因的细菌、酵母、动物细胞或植物细胞；其中优选的是酵母，更优选的是毕赤酵母，最优选的是毕赤酵母GS115。融合蛋白可以存在于宿主细胞内，也可以是从宿主中分泌出来，优选的，是从宿主本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种重组人血清白蛋白粒细胞集落刺激因子突变体(rmHSA？GCSF)，所述突变体中的人血清白蛋白的C末端可以直接或通过一柔性的连接肽序列与人粒细胞集落刺激因子的N端相连，或者人粒细胞集落刺激因子的C末端直接或通过一柔性的连接肽序列与人血清白蛋白的N端相连，所述人粒细胞集落刺激因子上第133位的Thr突变成Gly、Ala或Met。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：单剑峰，王昌梅，金荣，严春霞，张昕，戎亚雯，李亚飞，游修鼎，
申请(专利权)人：杭州九源基因工程有限公司，
类型：发明
国别省市：
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