本发明专利技术提供一种肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体胞外部分与XVIII型胶原蛋白NC1域或三聚域的融合蛋白，肽接头为[GlyGlyGlyGlySer]n，n为0-4的整数。通过构建重组融合蛋白基因；表达融合蛋白基因并进行复性。其中复性后的融合蛋白表现出较强的诱导肿瘤细胞凋亡活性。本发明专利技术利用XVIII型胶原蛋白NC1域融合TRAIL这一融合基因的设计，可延长相应融合蛋白在实验动物体内半衰期，克服TRAIL半衰期仅几分钟的缺点；NC1或三聚域具有极强的三聚特性，融合TRAIL后能稳定其三聚体，从而保持诱导肿瘤细胞凋亡活性；NC1域所含的内皮抑素域具有抑制新生血管生成的作用，此作用可与TRAIL的凋亡作用协同，增强融合蛋白的抗肿瘤效果。本发明专利技术方法可有效降低实验室或工业上生产融合蛋白的成本。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属生物
，具体而言，涉及协同抗肿瘤作用和蛋白稳定性的肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(TRAIL)与XVIII型胶原蛋白NCl域或三聚域(trimerizationdomain, TD)的融合蛋白，和融合蛋白包含体的复性、纯化方法。
技术介绍
肿瘤坏死因子(TNF)相关的凋亡诱导配体(TNF related apoptosis-inducingligand, TRAIL)是继TNF、FasL之后发现的第三个TNF家族的凋亡因子，为一种抗癌应用前景良好的生物药物。TRAIL由Wiley等从心肌cDNA文库中克隆出来的，因其氨基酸顺序具有TNF超家族的结构特征并能诱导Jurkat细胞和EB病毒转化的人类淋巴细胞凋亡而得 名。许多临床前期研究表明TRAIL能有效诱导多种癌细胞系凋亡，并同时保护正常细胞免于细胞毒副反应。目前国外已进行关于TRAIL及其受体激动型抗体的I、11期临床试验，并取得初步疗效。另外，TRAIL对NF- K B仅有很微弱的激活作用，即使是全身用药，也不会像TNF- a和Fas-L那样产生严重的炎症反应，这些特性使得TRAIL有成为新一代抗肿瘤药物的潜质。TRAIL又称凋亡素-2配体(Apo_2L)，属于TNF家族成员。TRAIL基因定位于染色体3q26，编码281个氨基酸，属于II型跨膜蛋白，N端无信号肽序列，第15_40位氨基酸形成疏水跨膜结构，胞内区非常短，C端胞外区为保守性强的114-281位氨基酸，形成典型的3折叠，为其与受体结合的部位。TRAIL分子量为32. 5kD，等电点7. 63，广泛表达于包括脾、淋巴结、肺、前列腺以及外周淋巴细胞等在内的大多数正常组织，但不表达于脑组织及睾丸中。研究证实TRAIL与死亡受体结合后能诱导多种肿瘤细胞凋亡，而对绝大多数正常细胞无毒副作用，同时发现激活的T细胞、NK细胞、单核细胞以及树突状细胞表达TRAIL，提示它在宿主防御和维持免疫稳态方面起作用，参与免疫调节。Sarah G. Hymowitz等研究发现TRAIL在形成三聚体时生物活性最强，同时受体激活时也成三聚体形式，三聚体顶部附近的锌结合位点对维持TRAIL的结构与稳定性起到重要作用，离体实验表明，全长或可溶形式的TRAIL形成的三聚体都可以快速诱导多种肿瘤细胞凋亡。TRAIL分子中还存在一些特殊位点，第109位的天冬氨酸(Asp)是一个潜在的N糖基化位点，可被金属蛋白酶从膜上切下而产生一相对分子质量为24000左右的可溶性活性肽段(114-281)，该片段可形成分子量分别为48 000和66 000左右的二聚体和三聚体，TRAIL的药物应用多采用此肽段。TRAIL与TNF家族其它成员最独特的区别在于其第137-152位氨基酸序列可形成一个由12-16个氨基酸组成的凸出的环(AA loop),此结构可插入受体的TRAIL结合位点，从而保证受体与TRAIL特异性结合，研究表明，此插入环与TRAIL细胞毒性作用有关。另外，TRAIL序列中Cys230残基在维持TRAIL的结构和生物活性中具有重要作用。若Cys230突变为Ala或Ser，TRAIL蛋白的稳定性下降，而且不能螯合锌原子形成三聚体，与受体结合能力也会下降200倍，严重影响TRAIL的诱导凋亡的活性。然而有研究表明高度聚合的重组TRAIL (如His-TRAIL，交联的FLAG-TRAIL)对体外培养一天的原代人肝细胞(PHH)有毒。未标记的Apo2L. O/TRAIL. O对人星形胶质细胞无毒，而经标记的类型如LZ-TRAIL、交联FLAG-TRAIL和His-TRAIL能诱导分离的成熟星形胶质细胞和培养的成熟脑部切片组织凋亡。LZ-TRAIL和His-TRAIL对增殖的原代人角化细胞有明显毒性，而未标记TRAIL毒性较弱。因此，重组TRAIL的类型决定了高秩序复合物的形成，聚合程度则在提高TRAIL效用的同时导致了对其他正常细胞的毒性。研究者认为His、FLAG、LZ和IZ等标签由于并非一个独立域(domain)，在融合表达蛋白质(如TRAIL)时，会有可能由于融合蛋白整体氨基酸序列的改变导致融合蛋白三级结构的改变，进而引进未知的毒性。Native TRAIL的三聚体对正常细胞毒性小，但它与标记型TRAIL相比抗癌效用更弱。交联的Flag-TRAIL和His-TRAIL能高效诱导肿瘤细胞凋亡，但同时也导致许多正常细胞凋亡。可供替代选择的是LZ-TRAIL和iz-TRAIL，它们的抗癌作用较理想同时对正常细胞毒性比M2/Flag-TRAIL或His-TRAIL小。可见重组TRAIL相对于hTRAIL的序列变化导致了融合蛋白功能的改变，增加了重组TRAIL抗肿瘤过程中对正常细胞的毒副作用，因此研究者在研究重组TRAIL的活性过程中，有必要关注因整体蛋白氨基酸序列的改变所引起的空间结构或折叠方式的改变，和进而引起的蛋白质功能变化。目前国内外的研究者们并未发现经标记的TRAIL对正常细胞产生毒性的确切原因。胶原蛋白X VDI属于被称之为 multiplexin (multiple triple-helix domainsand interuptions)的特殊胶原亚族，含有其他胶原蛋白所没有的C末端非三螺旋区(non-triple-helical regions or non-collagenous regions, NCl),这一特殊结构使其与其他仅由三螺旋结构组成的胶原相比拥有更好的灵活性。NCI域由三聚域(trimeri zat iondomain)、铰链区(hinge region)和内皮抑素域(endostatin domain)组成,在人和大鼠的血清中以三聚体的形式存在，且可以通过内源性水解作用释放endostatin, endostatin是一种重要的内源性血管新生抑制因子，因其高效、低毒和不产生耐药性而被作为新型抗肿瘤药物。NCl在水相溶液中表现出很强的三聚特性，可以在皮摩尔(picomolar)浓度时形成三聚体。NCl的三聚特性对胶原蛋白XVDI的三螺旋结构形成起到重要作用。Victor J等利用大鼠胶原蛋白XVDI的NCl域融合单链抗体(scFV)使之成功三聚化。研究者对NCl的晶体学结构研究表明，NCl在第162、264、294、302位存在Cys残基，且两两形成Cysl62_Cys302和 Cys264_Cys294 单体内二硫键,Endostatin 域中 Hisl、His3、Hisll 和 Asp76 螯合 Zn2+ 维持NCl的三级结构，Zn2+可能影响NCl经水解释放endostatin并激活其活性。因此，利用XVIII型胶原蛋白NCl域融合TRAIL，原理上可延长融合蛋白在实验动物体内半衰期，克服TRAIL半衰期仅几分钟的缺点；同时NCl或三聚域(TD)具有极强的三聚特性，融合TRAIL后能稳定其三聚体，从而保持诱导肿瘤细胞凋亡活性；此外，NCl域所含的内皮抑素域具有抑制新生血管生成的作用，此作用可与TRAIL的凋亡作用协同，增强融合蛋白的抗肿瘤效果。然而，原核表达系统(大肠杆菌)表达融合蛋白时，目的蛋白以包含体的形式存在于细胞内，需要进行复性后才可发挥其生物学功能。由本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体与XVIII型胶原蛋白NC1域或三聚域的融合蛋白，该融合蛋白特征为：含有肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体TRAIL氨基酸序列114？281部分、肽接头和XVIII型胶原蛋白NC1域或三聚域，其中所述的肽接头长0？20个氨基酸，该肽接头存在于人TRAIL和人NC1或TD之间，且所述肽接头的氨基酸选自甘氨酸、丝氨酸，所述肽接头为？[GlyGlyGlyGlySer]n？，n为0？4的整数。
【技术特征摘要】
1.一种肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体与XVIII型胶原蛋白NCl域或三聚域的融合蛋白，该融合蛋白特征为含有肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体TRAIL氨基酸序列114-281部分、肽接头和XVIII型胶原蛋白NCl域或三聚域，其中所述的肽接头长0-20个氨基酸，该肽接头存在于人TRAIL和人NCl或TD之间，且所述肽接头的氨基酸选自甘氨酸、丝氨酸，所述肽接头为[GlyGlyGlyGlySer]n , n为0_4的整数。2.根据权利要求I所述的一种肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体与XVIII型胶原蛋白NCl域或三聚域的融合蛋白，其特征在于所述的融合蛋白包含与人肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体残基序列相同的第一区和与人XVIII型胶原蛋白NCl域或三聚域残基序列相同的第二区，或上述二区的功能等同物。3.权利要求I所述的一种肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体与XVIII型胶原蛋白NCl域或三聚域的融合蛋白构建以及融合蛋白包含体复性方法，通过以下步骤实现 (1)构建重组融合蛋白基因，其中编码本发明融合蛋白的DNA序列...
【专利技术属性】
技术研发人员：潘利强，陈枢青，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：
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