本发明专利技术属于药物治疗肿瘤技术领域，涉及一种诱导肿瘤细胞凋亡的方法，先在肿瘤细胞中加入U0126工作液后，再加入与U0126工作液等体积的齐墩果酸工作液，36小时后检测细胞凋亡情况；或将肿瘤细胞加入小干扰RNA工作液后再加入肿瘤细胞培养基，然后加入齐墩果酸工作液，36小时后检测细胞凋亡情况；其选择的工艺路线合理，用药组合科学，诱导凋亡的条件易实现，效果明显，测定技术工艺成熟，应用前景良好。
【技术实现步骤摘要】
： 本专利技术属于药物治疗肿瘤
，涉及化合物与天然产物联合用药的效果测评 方法，具体涉及一种利用ERK信号通路抑制剂与齐墩果酸联合给药诱导肿瘤细胞凋亡的方 法。
技术介绍
： 齐墩果酸（(3 β ) -3-Hydroxyolean-12-稀-28-酸，也简称为0A)，天然五环三砲， 广泛分布于各种水果、蔬菜和药材中，并具有多种生物活性。齐墩果酸已知的生物活性包括 抗肿瘤，抗炎，抗高血糖，抗病毒和肝脏保护作用，而且齐墩果酸对正常细胞和组织没有显 著的细胞毒作用，由于其各种生物活性和极小的细胞毒作用，齐墩果酸一直备受科学家们 的关注，齐墩果酸的合成及其衍生物的合成也成为研究热点。大量证据表明，在肿瘤细胞中 齐墩果酸主要通过诱导凋亡途径发挥其抗肿瘤活性，然而最近的研究表明，齐墩果酸处理 的肿瘤细胞中，ERK信号通路被激活，从而引起下游信号通路中的的抗凋亡蛋白表达，降低 了齐墩果酸的抗肿瘤活性。但是，利用ERK信号通路抑制剂与齐墩果酸联合作用诱导肿瘤 细胞凋亡的技术尚未见有公开报道。
技术实现思路
： 本专利技术的目的在于克服现有技术存在的缺点，寻求设计一种采用EPK信号通路抑 制剂与齐墩果酸联合给药诱导肿瘤细胞凋亡的方法，鉴于细胞凋亡的发生过程，活性氧的 产生是齐墩果酸促凋亡活性的决定性因素，ERK的通路是细胞中一个关键的消除活性氧的 信号通路，将ERK信号通路抑制剂与齐墩果酸联合使用，促进活性氧的产生，增强齐墩果酸 诱导凋亡的能力和抗肿瘤作用。 为了实现上述目的，本专利技术涉及的具体工艺步骤包括： (1)肿瘤细胞培养：选用购自美国典型培养物保藏中心（Manassas，VA)肺腺癌 A549和PANC-1胰腺癌细胞，将肺腺癌A549和PANC-1胰腺癌细胞在胎牛血清体积比为10 % (英潍捷基公司）的RPMI1640肿瘤细胞培养基（Gibco)中，在C02体积百分比为5%的湿 润37°C条件下进行培养； ⑵化学试剂和小干扰RNA的获得：齐墩果酸购自SigmaAldrich公司（货 号05504) ;ERK抑制剂U0126购自细胞信号技术公司（货号#9903);靶向ERK的小干 扰RNA(siERK，货号#6560,10微摩尔/毫升）以及对应的对照小干扰RNA(货号#6568) 均购自细胞信号技术公司；小干扰RNA转染试剂为英潍捷基公司的L i pof ec t am i n e? RNAiMAX(货号13778);所有的工作液均需要在使用时现场配置，使用步骤（1)中的肿瘤细 胞培养基将齐墩果酸稀释至终浓度为200微克/毫升得到齐墩果酸工作液；使用步骤（1) 中的肿瘤细胞培养基将ERK抑制剂U0126稀释至终浓度为10微摩尔/毫升得到U0126工 作液；将3微升小干扰RNA母液加入150微升Opti-MEM培养基，同时再将9微升小干扰RNA 转染试剂加入150微升Opti-MEM培养基，将两者混合后室温环境下放置5分钟得到小干扰 RNA工作液； (3)齐墩果酸联合ERK通路抑制剂：齐墩果酸联合ERK通路抑制剂包括齐墩果酸 联合U0126和齐墩果酸联合ERK小干扰RNA两种方案，其中齐墩果酸联合U0126方案是按照 步骤⑴的条件培养肿瘤细胞24小时后，弃去肿瘤细胞培养基，加入步骤⑵中的U0126工 作液，1小时后，加入与U0126工作液等体积的齐墩果酸工作液，36小时后，按照步骤（4)的 方法检测细胞凋亡情况；齐墩果酸联合ERK小干扰RNA是按照步骤（1)的条件将0. 25 X 106个肿瘤细胞在6孔板中培养24小时后，弃去肿瘤细胞培养基，加入步骤（2)中的小干扰RNA 工作液；6小时后弃去培养基，再次加入步骤（1)的肿瘤细胞培养基，36小时后，加入与小干 扰RNA工作液等体积的齐墩果酸工作液，36小时后，按照步骤（4)的方法检测细胞凋亡情 况； (4)细胞凋亡状况检测：采用免疫印迹法检测细胞凋亡状况时，使用M-PER哺乳动 物蛋白提取试剂（热电科学公司）从细胞中提取总蛋白，在重量百分比浓度为10-12%的 SDS-PAGE上分离，然后转移到0. 45微米孔径的硝酸纤维素膜上；再将所得的膜使用重量百 分比浓度5%的BSA孵育1小时，然后使用一抗在湿润的4°C条件下孵育12-16小时；最后 用二抗识别结合的一抗，以 SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate (热 电科学公司）作为底物对目标蛋白质的条带显影；所述的一抗和二抗均为细胞信号技术公 司，包括：cleaved PARP,货号 #5625;cleaved caspase-3,货号 #9664;0_tubulin,货号 #2146 ;辣根过氧化物酶偶联的山羊抗兔免疫球蛋白G，货号#7074 ;辣根过氧化物酶偶联的 马抗小鼠免疫球蛋白G，货号#7076 ;采用流式细胞方法检测细胞凋亡状况时，先进行流式 细胞术分析，确定凋亡细胞的百分比，具体方法为加入质量百分比浓度为70%乙醇水溶液 放置1小时，10毫克/毫升RNA酶A在37°C消化1小时，然后使用浓度为200毫克/毫升 碘化丙啶（PI)染色，最后通过流式细胞术分析（AriaII，BD Biosciences公司），每个样品 进行1 X 105个细胞计数，得到凋亡细胞的数目和比例；其检测结果显示，抑制ERK途径能够 增强齐墩果酸的抗肿瘤活性，促进肿瘤细胞凋亡将齐墩果酸联合ERK抑制剂用药，显著增 加肿瘤细胞的凋亡水平；在A549肺癌细胞中，齐墩果酸联合U0126使细胞凋亡率上升50 %; 齐墩果酸联合小干扰RNA使细胞凋亡率上升25 % ;在PANC-1细胞中，齐墩果酸联合U0126 使细胞凋亡率上升25 % ;齐墩果酸联合小干扰RNA使细胞凋亡率上升30 %。 本专利技术与现有技术相比，其选择的工艺路线合理，用药组合科学，诱导凋亡的条件 易实现，效果明显，测定技术工艺成熟，应用前景良好。【附图说明】： 图1为本专利技术实施例1和2诱导凋亡的效果图，其中A为A549使用齐墩果酸联合 U0126用药后，使用免疫印迹法检测肿瘤细胞凋亡水平；B为A549使用齐墩果酸联合U0126 用药后，使用流式细胞术检测肿瘤细胞凋亡水平；C为A549使用齐墩果酸联合小干扰RNA 用药后，使用免疫印迹法检测肿瘤细胞凋亡水平；D为A549使用齐墩果酸联合小干扰RNA 用药后，使用流式细胞术检测肿瘤细胞凋亡水平。 图2为本专利技术实施例3和4诱导凋亡的效果图，其中A为PANC-1使用齐墩果酸联 合U0126用药后，使用免疫印迹法检测肿瘤细胞凋亡水平；B为PANC-1使用齐墩果酸联合 U0126用药后，使用流式细胞术检测肿瘤细胞凋亡水平；C为PANC-1使用齐墩果酸联合小干 扰RNA用药后，使用免疫印迹法检测肿瘤细胞凋亡水平；D为PANC-1使用齐墩果酸联合当前第1页1 2 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种诱导肿瘤细胞凋亡的方法，其特征在于具体工艺步骤包括：(1)肿瘤细胞培养：将肺腺癌A549和PANC‑1胰腺癌细胞在胎牛血清体积比为10％的RPMI 1640肿瘤细胞培养基中，在CO2体积百分比为5％的湿润37℃条件下进行培养；(2)化学试剂和小干扰RNA的获得：使用步骤(1)中的肿瘤细胞培养基将齐墩果酸稀释至终浓度为200微克/毫升得到齐墩果酸工作液；使用步骤(1)中的肿瘤细胞培养基将ERK抑制剂U0126稀释至终浓度为10微摩尔/毫升得到U0126工作液；将3微升靶向ERK的小干扰RNA母液加入150微升Opti‑MEM培养基，同时再将9微升小干扰RNA转染试剂加入150微升Opti‑MEM培养基，将两者混合后室温环境下放置5分钟得到小干扰RNA工作液；(3)齐墩果酸联合ERK通路抑制剂：齐墩果酸联合ERK通路抑制剂包括齐墩果酸联合U0126和齐墩果酸联合ERK小干扰RNA两种方案，其中齐墩果酸联合U0126方案是按照步骤(1)的条件培养肿瘤细胞24小时后，弃去肿瘤细胞培养基，加入步骤(2)中的U0126工作液，1小时后，加入与U0126工作液等体积的齐墩果酸工作液，36小时后，按照步骤(4)的方法检测细胞凋亡情况；齐墩果酸联合ERK小干扰RNA是按照步骤(1)的条件将0.25×106个肿瘤细胞在6孔板中培养24小时后，弃去肿瘤细胞培养基，加入步骤(2)中的小干扰RNA工作液；6小时后弃去培养基，加入步骤(1)的肿瘤细胞培养基，36小时后，加入与小干扰RNA工作液等体积的齐墩果酸工作液，36小时后，按照步骤(4)的方法检测细胞凋亡情况；(4)细胞凋亡状况检测：采用免疫印迹法检测细胞凋亡状况时，使用M‑PER哺乳动物蛋白提取试剂从细胞中提取总蛋白，在重量百分比浓度为10‑12％的SDS‑PAGE上分离，然后转移到0.45微米孔径的硝酸纤维素膜上；再将所得的膜使用重量百分比浓度5％的BSA孵育1小时，然后使用一抗在湿润的4℃条件下孵育12‑16小时；最后用二抗识别结合的一抗，以SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate作为底物对目标蛋白质的条带显影；采用流式细胞方法检测细胞凋亡状况时，先进行流式细胞术分析，确定凋亡细胞的百分比，具体方法为加入质量百分比浓度为70％乙醇水溶液放置1小时，10毫克/毫升RNA酶A在37℃消化1小时，然后使用浓度为200毫克/毫升碘化丙啶染色，最后通过流式细胞术分析对每个样品进行1×105个细胞计数，得到凋亡细胞的数目和比例；其检测结果显示，抑制ERK途径能够增强齐墩果酸的抗肿瘤活性，促进肿瘤细胞凋亡将齐墩果酸联合ERK抑制剂用药，显著增加肿瘤细胞的凋亡水平；在A549肺癌细胞中，齐墩果酸联合U0126使细胞凋亡率上升50％；齐墩果酸联合小干扰RNA使细胞凋亡率上升25％；在PANC‑1细胞中，齐墩果酸联合U0126使细胞凋亡率上升25％；齐墩果酸联合小干扰RNA使细胞凋亡率上升30％。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：刘佳，马蕾娜，陈潇，
申请(专利权)人：青岛大学，
类型：发明
国别省市：山东;37
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