一种高效诱导γδT细胞的方法及应用技术

本发明专利技术提供了一种用于培养γδT细胞的培养基，γδT细胞的培养方法，通过该方法获得的高效诱导的γδT细胞及其制剂，以及所述高效诱导的γδT细胞在制备提高患者基础免疫功能、提高抵抗肿瘤和抗感染能力的药物中的用途。

【技术实现步骤摘要】

：本专利技术涉及免疫细胞体外培养领域，具体是指一种高效诱导γδT细胞的制备方法以及细胞制剂。
技术介绍
：人体内T淋巴细胞根据T细胞受体(TCR)双链肽的构成不同，可以分为TCRαβT细胞(简称αβT细胞)和TCRγδT细胞(简称γδT细胞)，其中γδT细胞以主要组织相容性复合物(Major histocompatibility complex，MHC)非限制的方式直接识别并结合抗原分子，并通过穿孔素-颗粒酶、Fas/FasL、IFN-γ分泌以及TNF相关凋亡诱导配体受体TRAILR等途径杀伤肿瘤细胞及病毒感染细胞。γδT细胞除能有效杀伤肿瘤细胞外，还可以通过分泌IFN-γ等细胞因子，促进其他免疫细胞的活化，因此在天然免疫和适应性免疫应答中发挥重要的免疫监视和免疫调节作用，被认为是联系天然免疫与适应性免疫的重要桥梁。γδT细胞具有NK细胞与T细胞的双重特征，表面除表达TCRγδ外，还高水平表达NK细胞的活化性重要功能受体NKG2D，这两种受体分子在γδT细胞对肿瘤细胞的杀伤过程中发挥重要作用。其中，单一的TCRγδ即可使γδT细胞活化，而NKG2D在此过程中则起到共刺激作用，使得γδT细胞在识别抗原后快速活化并产生相应的生物学效应，在机体抵御肿瘤或感染时快速活化，从而发挥抗肿瘤或抗感染的重要作用。此外，研究发现由于γδT细胞具有无MHC限制性的杀瘤作用，对多种自体、同种异体或异种肿瘤细胞均表现出显著的杀伤活性，因此γδT细胞作为一类重要的肿瘤过继免疫治疗的候选细胞引起越来越多国内、外学者的关注。但是另一方面，由于γδT细胞在人体外周血仅占1-5％，要获得大量高细胞毒活性的γδT细胞是十分困难的，因而限制了其临床应用。虽然已有技术多采用抗TCRγδ抗体或非肽膦酸类抗原获得大量γδT细胞，但因费用相对昂贵且扩增倍数有限而未得到广泛应用。因此，为了克服现有技术的不足，本专利技术提供一种经济实用、高效快速扩增人体外周血γδT细胞的方法，用以提高患者基础免疫功能、提供患病机体抵抗肿瘤和抗感染能力。同时对于人外周血γδT细胞制备后需要对其进行细胞数量、纯度、免疫表型检测，确保其能有效发挥一定的临床治疗效果。
技术实现思路
：本专利技术的目的是提供一种经济实用、高效快速扩增人体外周血γδT细胞的方法，提高γδT细胞的数量、纯度和杀伤活性以确保临床应用。一方面，本专利技术提供了一种专门用于培养γδT细胞的培养基，由培养基组分I、γδT细胞特异性培养基组分II构成，其中所述培养基组分I包括以下含量的成分：RPMI-1640培养基，其中添加有浓度为1-10mM的L-谷氨酰胺，浓度为5-20mg/L的重组人转铁蛋白，浓度为1-10g/L的重组人白蛋白，浓度为1-10mg/L的重组人胰岛素，浓度为10-100mg/L的维生素PP，浓度为10-50mg/L的维生素C，浓度为1-50ng/mL的氢化可的松，浓度为1-10mg/L微量元素；所述γδT特异性培养基组分II是由以下浓度的组分构成：PMA浓度为10-50ng/ml，离子霉素浓度为0.5-5ug/ml，rhIL-2浓度为100-1000IU/ml，rhIL-18浓度为5-20ng/ml。本专利技术上述专用γδT细胞培养基还可以进一步含有体积比为1-10％的血清，优选自体血清，更优选含有5％自体血清。在本专利技术的优选技术方案中，所述培养基组分I是无血清培养基：所述微量元素选自硒。同现有技术相比，本专利技术的专用于培养γδT细胞的培养基中包含了一些能促进γδT细胞特异性增殖及分化的组分，从而能够得到数量更多，纯度更高且杀伤活性更强的γδT细胞。本专利技术的专用于培养γδT细胞的培养基具有以下优点：1)避免由于在γδT细胞培养过程中使用动物血清对患者带来的风险以及动物血
清中的不确定成分对细胞培养造成的不利影响；2)增加了γδT细胞得率，提高了纯度，并降低了细胞培养的生产成本。另一方面，本专利技术提供了一种高效诱导γδT细胞的方法，即一种新的制备γδT细胞的方法，其特征在于将外周血单个核细胞用培养基组分I重悬至1X106-5X106/ml，所述培养基组分I包括以下含量的成分：RPMI-1640培养基，其中添加有浓度为1-10mM的L-谷氨酰胺，浓度为5-20mg/L的重组人转铁蛋白，浓度为1-10g/L的重组人白蛋白，浓度为1-10mg/L的重组人胰岛素，浓度为10-100mg/L的维生素PP，浓度为10-50mg/L的维生素C，浓度为1-50ng/mL的氢化可的松，浓度为1-10mg/L微量元素，每2-3天更换培养基，所用培养基为培养基组分I，在孵育箱中培养，同时加入γδT特异性培养基组分II，所述γδT特异性培养基组分II由以下浓度的组分构成：PMA浓度为10-50ng/ml，离子霉素浓度为0.5-5ug/ml，rhIL-2浓度为100-1000IU/ml，rhIL-18浓度为5-20ng/ml。在本专利技术的一个优选实施方案中，所述培养基组分I是无血清培养基；所述微量元素选自硒。在本专利技术的另一个优选实施方案中，上述本专利技术制备γδT细胞的方法中，所述培养基组分I或者γδT特异性培养基组分II可以进一步含体积比为1-10％的血清。更优选地，含有体积比为5％的自体血清。在实施本专利技术时，为了对比，使用optimizer培养基作为对照组培养基，包括AIM-V培养基。在将外周血单个核细胞用γδT细胞培养基将细胞重悬至1X106-5X106/ml之后，根据细胞的生长状况，每2-3天更换培养基，所用γδT细胞培养基分别为两种不同γδT细胞培养基(即本专利技术的上述γδT细胞专用培养基或者optimizer培养基作为对照组培养基，后者包括AIM-V培养基)，在孵育箱中培养，同时补充全量各种细胞因子(即本专利技术γδT特异性培养基组分II)，持续培养，获得大量较高浓度的γδT细胞。第三方面，本专利技术提供了通过本专利技术培养基制备的γδT细胞，含有本专利技术方法
制备的γδT细胞的细胞制剂以及该制剂的应用。本专利技术还提供了本专利技术培养基制备的γδT细胞在制备提高患者基础免疫功能、提高抵抗肿瘤和抗感染能力的药物中的用途。附图的简要说明：图1是本专利技术培养基制备的γδT细胞增殖倍数与对照组的比较。图2是本专利技术培养基制备的γδT细胞培养终密度与对照组的比较。图3是本专利技术γδT细胞流式检测结果。图4是本专利技术γδT细胞杀瘤活性检测结果。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术作进一步说明，但是不应该理解是对本专利技术保护范围的限制。实施例1：γδT细胞的培养将采集的外周血15ml，通过密度梯度离心获得外周血单个核细胞。使用本专利技术无血清培养基组分I将获得的外周血单个核细胞重悬至1X106/ml。所述无血清培养基组分I是由以下浓度的组分构成的：RPMI-1640培养基(购自美国Gibco公司，货号：31800-105)，其中添加有浓度为5mM的L-谷氨酰胺，浓度为10mg/L的重组人转铁蛋白，浓度为5g/L的重组人白蛋白，浓度为5mg/L的重组人胰岛素，浓度为50mg/L的维生素PP，浓度为30mg/L的维生素C，浓度为30ng/mL的氢化可的松，浓度为5mg/L的硒。根据细胞的生本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于培养γδT细胞的培养基，其特征在于由培养基组分I和γδT细胞特异性培养基组分II构成，其中所述培养基组分I包括以下含量的成分：RPMI‑1640培养基，其中添加有浓度为1‑10mM的L‑谷氨酰胺，浓度为5‑20mg/L的重组人转铁蛋白，浓度为1‑10g/L的重组人白蛋白，浓度为1‑10mg/L的重组人胰岛素，浓度为10‑100mg/L的维生素PP，浓度为10‑50mg/L的维生素C，浓度为1‑50ng/mL的氢化可的松，浓度为1‑10mg/L微量元素，所述γδT特异性培养基组分II由以下浓度的组分构成：PMA浓度为10‑50ng/ml，离子霉素浓度为0.5‑5ug/ml，rhIL‑2浓度为100‑1000IU/ml，rhIL‑18浓度为5‑20ng/ml。

【技术特征摘要】
1.一种用于培养γδT细胞的培养基，其特征在于由培养基组分I和γδT细胞特异性培养基组分II构成，其中所述培养基组分I包括以下含量的成分：RPMI-1640培养基，其中添加有浓度为1-10mM的L-谷氨酰胺，浓度为5-20mg/L的重组人转铁蛋白，浓度为1-10g/L的重组人白蛋白，浓度为1-10mg/L的重组人胰岛素，浓度为10-100mg/L的维生素PP，浓度为10-50mg/L的维生素C，浓度为1-50ng/mL的氢化可的松，浓度为1-10mg/L微量元素，所述γδT特异性培养基组分II由以下浓度的组分构成：PMA浓度为10-50ng/ml，离子霉素浓度为0.5-5ug/ml，rhIL-2浓度为100-1000IU/ml，rhIL-18浓度为5-20ng/ml。2.一种权利要求1的用于培养γδT细胞的培养基，其特征在于其中所述微量元素是硒。3.一种权利要求1或2的用于培养γδT细胞的培养基，其特征在于进一步含有体积比为1-10％的血清。4.一种制备γδT细胞的方法，其特征在于将外周血单个核细胞用培养基组分I重悬至1X106-5X106/ml，所述培养基组分I包括以...

【专利技术属性】
技术研发人员：卢戌，刘静维，王跃，杨照敏，
申请(专利权)人：北京康爱瑞浩生物科技股份有限公司空港分公司，
类型：发明
国别省市：北京;11