一种杂合肽囊素佐剂及其制备方法和应用技术

本发明专利技术属于分子免疫学技术领域，具体涉及一种杂合肽囊素佐剂及其制备方法和应用。主要技术方法如下：先设计出14个囊素三肽的氨基酸序列（Lys-His-Gly-NH2）和2个活性四肽的氨基酸序列（Lys-Asn-Pro-Tyr）密码子为主体的杂合肽囊素N197的核酸序列。接着构建了重组表达载体PET32a-N197，将其转入BL-21（DE3）大肠杆菌后，杂合肽囊素N197获得了高效表达。纯化后的杂合肽囊素N197具有显著的免疫佐剂的特性。本发明专利技术中的杂合肽囊素N197具有高效的佐剂特性，且利用大肠杆菌系统可以在体外对其进行大规模的生产，其生产成本低，生产效率高，生物活性好，非常适合企业化生产，具有很好的作为畜禽免疫佐剂的应用前景。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于分子免疫学
，具体涉及一种杂合肽囊素佐剂及其制备方法和应用。
技术介绍
Lys-His-Gly-NH2三肽是一种可以诱导B淋巴细胞分化的激素样物质，它不仅可以通过诱导干细胞的分化和作用于B淋巴细胞对机体免疫球蛋白的多样化性产生影响，而且还可以促进机体的IgM向IgG的方向发生变转，因其最早是从鸡法氏囊中提取的，所以称之为囊素三肽。1991年，Aydhya等发现囊素不仅仅存在于禽类法氏囊中，还存在于哺乳动 物的骨髓和胆管上皮细胞中。在哺乳动物中分离的囊素是以前囊素状态出现的，它是一种序列为 Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Lys-Pro-Arg-Lys-His-Gly-Gly-Arg-Arg 的 14 妝结构。从序列上我们可以看出其第9位、第10位和第11位这三个连续的氨基酸正好是囊素三肽的序列。Aydhya的研究还证实了此14肽的前囊素与囊素三肽有着相似的生物学活性。因此，我们可以推断融合状态的前囊素并不影响三肽生物活性的发挥。近年来国外对有免疫活性的多肽的序列和结构有详细的研究，其中有一种叫做加加尼翁(Gagnon’s peptide)的四肽,其氨基酸序列为Lys-Asn-Pro_Tyr。这个四肽序列被证实也是B细胞刺激物，可以增加鸡新城疫疫苗等抗体效价。为了研究重组疫苗免疫佐剂，本研究利用分子生物学的方法设计了 14个囊素三肽和2个加加尼翁四肽的杂合序列，并在序列的末端增加了 6个组氨酸的标签序列，最终序列长度为197bp，我们命名其为杂合肽囊素N197。通过合成N197的杂合多肽序列以及体外和体内动物实验来验证基因工程免疫增强剂杂合多肽的免疫活性。
技术实现思路
(一)本专利技术要解决的技术问题是提供一种可广泛用于疫苗制备，生产成本低，免疫佐剂效果好的新型杂合肽囊素免疫佐剂及其制备方法和应用。(二)本专利技术的技术方案是I杂合肽囊素N197的设计合成14个囊素三肽的氨基酸序列(Lys-HiS-Gly-NH2)和2个加加尼翁活性四肽的氨基酸序列(Lys-Asn-Pro-Tyr)所对应的密码子共有150bp的核苷酸。另外，在核酸序列的前面添加一个起始密码子的序列(3bp)和一个限制性内切酶EcoRI的酶切位点(6bp)。在序列的末端加上6个组氨酸的序列(18bp)，一个终止密码子(3bp)，另外加上三个限制性内切酶(Xho I1Sal I1Pst I)的核酸序列(17bp)。这样设计好的杂合肽囊素核酸序列共包括197个核苷酸(N197序列)。2含有杂合肽囊素N197序列原核表达载体的构建与鉴定把合成好的杂合肽囊素N197序列与线性化后的PET32a(Novagen公司商品化产品)原核表达载体进行连接，连接产物转化大肠杆菌宿主后，用酶切鉴定的方法筛选含N197的PET32a载体的宿主菌。3杂合肽囊素在大肠杆菌中的诱导表达以终浓度为ImM的IPTG (异丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷)对含杂合肽囊素序列的宿主菌进行诱导表达，同时以含PET32a空载体质粒的BL-21菌同样诱导处理后样品为阴性对照。以SDS-PAGE电泳结果来分析杂合肽囊素在大肠杆菌中的表达水平。4重组大肠杆菌杂合肽囊素N197的纯化利用SDS-PAGE电泳来对杂合肽囊素N197的表达条带进行分离，并通过切胶回收的方法对重组杂合肽囊素N197进行分离、纯化，并可以进一步利用SDS-PAGE电泳对切胶回收的杂合肽囊素N197的纯度进行分析。 5纯化后的重组杂合肽囊素N197的体外免疫活性测定(碧云天生物公司的CCK8试剂盒)取鸡外周血，并分离出淋巴细胞，在LPS的作用下，测定纯化后的重组杂合肽囊素N197在体外促进B淋巴细胞增殖的免疫活性，并设立相应的阴性对照和空白对照。6重组杂合肽囊素N197体外免疫佐剂活性的测定把I日龄的SPF级白色来航鸡在SPF饲养至10日龄后分为A，B，C和D等4组，每组3只鸡。其中A组为商品化的鸡传染性法氏囊病灭活疫苗免疫组(采用市售商品化鸡传染性法氏囊病的灭活苗在鸡颈部皮下注射200 μ I) ；Β组为联合免疫组(用商品化的鸡传染性法氏囊病灭活疫苗颈部皮下注射加200 μ I切胶回收的O. 14mg/ml的N197) ；C组为阳性攻毒组(不免疫，进行攻毒);D组为空白对照组(不免疫，不攻毒)。对各组中需要免疫的鸡只按上述方案进行免疫，在24日龄时加强免疫一次，疫苗接种剂量及各组免疫增强剂的添加情况同第一次免疫。7杂合肽囊素N197对商品化鸡IBD疫苗免疫抗体水平的影响在第二次免疫13日后，即鸡群37日龄时对鸡群进行翅静脉采血。具体方法如下 (I)固定鸡只，使鸡的翅膀上翻(注意勿使鸡翅膀折伤或脱臼)；(2)在鸡翅中部选取翅静脉比较清楚的位置用70%酒精棉球消毒并使血管得以扩张;(3)用Iml的一次性无菌注射器在消毒部位采血约Iml/只；(4)将采集的鸡血在室温放置Ih后于4°C冰箱过夜。次日，以2000rpm，4°C离心IOmin并小心吸取上清；(5)采用琼扩实验方法测定血清中鸡IBD抗体的水平和效价。中间孔加入标准鸡传染性法氏囊病琼扩抗原，周围的孔中分别加入采集的免疫鸡群及对照组实验鸡只的抗血清。8杂合肽囊素N197对攻毒后鸡法氏囊的保护作用分析鸡群采血后立即对其进行攻毒，每只鸡采用滴眼的方式滴加90 μ I鸡IBDV的强毒株BC6/85的病毒液(约1000 EID5tlX攻毒6天后，处死所有鸡群并对其进行剖检。主要取鸡的脾脏和法氏囊组织称重后立即放入10%的福尔马林溶液进行固定后进行病理切片分析。(三)本专利技术其有益效果是目前，畜禽疫苗所使用的佐剂主要还是矿物油类佐剂为主，虽然油佐剂的免疫效果得到了认可，但是其的主要缺陷在于其具有一定的毒副作用(引起局部炎症等等)。本研究制备的杂合肽囊素N197作为疫苗佐剂主要有如下几方面的有益效果I杂合肽囊素N197是一种高效、低廉，安全的畜禽疫苗佐剂囊素三肽作为疫苗佐剂的免疫促进作用已被广泛证实，但是由于天然提取的囊素三肽工艺复杂，得率较低，成本昂贵，所以用天然提取的囊素工作畜禽用佐剂几乎没有可能性。而本研究采用大肠杆菌系统在体外表达杂合肽囊素N197，此方法获得的重组蛋白的效率很高，且大肠杆菌系统生产外源蛋白的成本比较低，因此，杂合肽囊素N197是一种高效，低廉的免疫佐剂。另外，由于囊素三肽和加加尼翁活性四肽是家禽等生物体内本身存在的一种小肽，且多肽在自然环境中易降解，因此，把多个囊素三肽和加加尼翁活性四肽的密码子串联后，在体外表达的重组杂合肽囊素N197对畜禽来说应该是一种比较安全的免疫佐剂。2重组杂合肽囊素N197是一种具有广谱促免疫作用的免疫佐剂 该佐剂能提高多种畜禽疫苗的免疫效果，这直接减少了畜禽患病的机会，间接增加了养殖户的收入和经济效应。同时，该新型佐剂的应用可望提高传统疫苗的免疫效果，降低畜禽重大传染病的防治成本。3重组杂合肽囊素N197是一种绿色、环保的免疫佐剂该免疫佐剂可降低畜禽疫苗抗原的使用量，从而减少了因大量繁殖病毒对疫苗生产区域的环境和疫苗使用场所周围环境的污染程度，降低企业的生产成本，是一种绿色、环保免疫佐剂。此外，重组杂合肽囊素N197属于重组多肽佐剂，其在自然界中可以被降解，不会对环境和其他生物造成生物危害。四附本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种杂合肽囊素N197佐剂，其特征是由14个囊素三肽的氨基酸序列Lys？His？Gly？NH2和2个活性四肽的氨基酸序列Lys？Asn？Pro？Tyr及6个组氨酸组成的杂合多肽序列。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：沈萍萍，蔡梅红，
申请(专利权)人：南京大学，
类型：发明
国别省市：