本发明专利技术提供了一种片段缩合制备胸腺肽α1的方法，属于生化技术领域。该方法利用高荷载量（≥0.8mmol/g树脂）的树脂为起始原料，先采用标准的固相多肽合成(SPPS)技术合成选定结构的高纯度肽片段，再采用固相和/或液相片段缩合技术连接肽片段，从而获得高纯度(＞99%)的目标肽。相比较固相合成胸腺肽α1的工艺，本发明专利技术避免了12位以后氨基酸偶联率低的问题，大大提高了胸腺肽α1的收率（达25～30%）；同时固相合成的肽片段不必纯化；最终用高效液相色谱纯化胸腺肽α1，降低制备难度，减少制备次数，大大简化了后处理工艺，降低了胸腺肽α1的合成成本，有利于实现规模化、产业化生产。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术提供了一种片段缩合制备胸腺肽α1的方法，属于生化
。该方法利用高荷载量（≥0.8mmol/g树脂）的树脂为起始原料，先采用标准的固相多肽合成(SPPS)技术合成选定结构的高纯度肽片段，再采用固相和/或液相片段缩合技术连接肽片段，从而获得高纯度(＞99%)的目标肽。相比较固相合成胸腺肽α1的工艺，本专利技术避免了12位以后氨基酸偶联率低的问题，大大提高了胸腺肽α1的收率（达25～30%）；同时固相合成的肽片段不必纯化；最终用高效液相色谱纯化胸腺肽α1，降低制备难度，减少制备次数，大大简化了后处理工艺，降低了胸腺肽α1的合成成本，有利于实现规模化、产业化生产。【专利说明】一种固液相片段缩合制备胸腺肽的方法
本专利技术属于生化
，涉及一种胸腺肽α I的合成方法，尤其涉及一种固液相片段缩合制备胸腺肽α I的方法。
技术介绍
胸腺肽α I (又称胸腺素α 1、胸腺法新)是一种具有下式结构的胸腺肽:Ac_SDAAVDTSSEITTKDLKEKKEVVEEAEN-COOH。胸腺肽α I是哺乳动物胸腺中存在的单一组分的多肽化合物，是由28个氨基酸残基和N端氨基酸乙酰化构成的多肽，是与免疫细胞发育分化相关的分子，具有使T淋巴细胞分化、增殖、提高细胞免疫功能的作用，能破坏被感染的靶细胞，还可激活NK细胞活性，促进与免疫相关的细胞因子的产生。胸腺肽α I的活性较胸腺五肽高10到1000倍，是复合治疗慢性乙肝、丙肝、免疫缺陷综合症药物，在非小细胞肺癌、恶性黑色素瘤治疗中也发挥了较大的作用。胸腺肽α I于1997年由意大利赛生(Sciclone)公司开发上市，现己被24个国家批准用于慢性乙型肝炎(HBV)的治疗，在欧美日等国也用于治疗丙型肝炎(HCV)、肝细胞癌及增强免疫疾病的治疗。1983年公开的美国专利US4504415使用全液相合成胸腺肽α I。最近的胸腺肽α I及其类似物的制备方法主要有两种，其中一种是采用生物合成技术，在2003年I月I日公开的中国专利技术专利(CN1388133A)中，利用人工基因合成技术获得胸腺肽α I的全序列。另一种为固相合成方法，“化学学报”2004年第55卷第2期《胸腺素α I的DIC固相化学合成与鉴定》中提到，以Wang Resin为起始原料，通过激活试剂DIC+HOBt将Fmoc-Asn (Trt) -OH与树脂相连接；“天津药学”2001年6月第13卷第3期《Fmoc新型固相法合成胸腺素α I及其反应途径》中提到，以HMP树脂为起始原料，通过激活试剂DCC+ HOBt将Fmoc-Asn (Trt) -OH与树脂相连接。中国专利 CN200610024610.0、CN200680014615.3、CN200710024406.3、CN200780024724.8、CN201110069876.8 均为固相合成胸腺肽 α I。综合参考国内外关于胸腺肽α I制备方法以及相关的合成报道文献，发现这些技术都存在一些不足，主要表现在:①全液相合成费时，需要良好的后处理技术生物合成技术难以规模化生产；③常规固相合成方法难以获得高纯度的胸腺肽α 1，而且收率低(5~10%)，导致生产成本高。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术中存在的问题，提供一种固液相片段缩合制备胸腺肽α I的方法。本专利技术一种固液相片段缩合制备胸腺肽α I的方法，包括在固相支持体上合成胸腺肽α I的侧链保护肽片段，在固/液相中缩合侧链保护肽片段，形成保护的胸腺肽α 1，然后将侧链和羧基端去保护，获得目的肽。其具体制备工艺如下:Cl)将结构为Fmoc-KEKKEVVEEAEN-Y的侧链保护肽的氨基端去保护，得nh2-kekkevveeaen-y ；其中，结构为Fmoc-KEKKEVVEEAEN-Y的侧链保护肽用以下方法合成: a、将结构为Fmoc-EAEN-COOH的侧链保护肽羧基端保护，得到结构为Fmoc-EAEN-Y的侧链保护肽；并将肽氨基端去保护，得结构为NH2-EAEN-Y的侧链保护肽； b、采用液相片段缩合方法，使肽NH2-EAEN-Y与结构为Fmoc-EVVE-COOH的侧链保护肽反应，产生结构Fmoc-EVVEEAEN-Y的羧基保护的侧链保护肽；并对该肽氨基脱保护，得结构为NH2-EVVEEAEN-Y的侧链保护肽片段； C、采用液相片段缩合方法，使肽NH2-EVVEEAEN-Y与结构为Fmoc-KEKK-COOH的侧链保护肽反应，获得结构为Fmoc-KEKKEVVEEAEN-Y的侧链保护肽。上述结构为Fmoc-KEKKEVVEEAEN-Y的侧链保护肽也可以用以下方法合成: a、将结构为Fmoc-EVVEEAEN-COOH的侧链保护肽羧基端进行保护，得到结构为Fmoc-EVVEEAEN-Y的侧链保护肽片段，并使该肽片段的氨基端去保护，得到结构为NH2-EVVEEAEN-Y的侧链保护肽； 其中Fmoc-EVVEEAEN-COOH侧链保护肽可采用经典的固相合成方法合成，也可以采用固相片段缩合工艺合成，即将Fmoc-EVVE-COOH侧链保护肽在固相体系中以1.5eq缩合于肽树脂NH2-EAEN-resin上，进而裂解肽树脂得到Fmoc- EVVEEAEN-C00H侧链保护肽。b、采用液相片段缩合方法，将侧链保护肽nh2-evveeaen-y与结构为Fmoc-KEKK-COOH的侧链保护肽反应，产生结构为Fmoc-KEKKEVVEEAEN-Y的羧基保护的侧链保护肽。 上述结构为Fmoc-KEKKEVVEEAEN-Y的侧链保护肽还可用以下方法合成: a、将结构为Fmoc-EAEN-COOH的侧链保护肽羧基端保护，得到结构为Fmoc-EAEN-Y的侧链保护肽，并使肽氨基端去保护，得侧链保护肽NH2-EAEN-Y ； b、采用液相片段缩合方法，使侧链保护肽NH2-EAEN-Y与结构为Fmoc-KEKKEVVE-COOH的侧链保护肽反应，产生Fmoc-KEKKEVVEEAEN-Y羧基保护的侧链保护肽。(2)采用液相片段缩合方法使结构为nh2-kekkevveeaen-y的侧链保护肽与结构为Fmoc-EITTKDL-COOH的侧链保护肽缩合，得到结构为Fmoc-EITTKDLKEKKEVVEEAEN-Y的羧基保护的侧链保护肽；再脱去氨基Fmoc保护，得侧链保护肽NH2-EITTKDLKEKKEVVEEAEN-Y ； (3 )采用液相片段缩合方法将侧链保护肽nh2-eittkdlkekkevveeaen-y与结构为Fmoc-SDAAVDTSS-COOH 的侧链保护肽缩合，产生结构为 Fmoc-SDAAVDTSSEITTKDLKEKKEVVEEAEN-Y羧基保护的侧链保护肽，然后脱去氨基端Fmoc保护，并将氨基末端乙酰化，产生结构为 Ac-SDAAVDTSSEITTKDLKEKKEVVEEAEN-Y 羧基保护的侧链保护肽。或采用液相片段缩合方法将侧链保护肽nh2-eittkdlkekkevveeaen-y与结构为Ac-SDAAVDTSS-COOH 的侧链保护肽反应，产生结构为 Ac_SDAAVDTSSEITTKDLKEKKEVVEEAEN-Y羧基保护的侧链保护肽。(4)将肽本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种固液相片段缩合制备胸腺肽α1的方法，包括以下工艺步骤：（1）将结构为Fmoc‑KEKKEVVEEAEN‑Y的侧链保护肽的氨基端去保护，得NH2‑KEKKEVVEEAEN‑Y；（2）采用液相片段缩合方法使结构为NH2‑KEKKEVVEEAEN‑Y的侧链保护肽与结构为Fmoc‑EITTKDL‑COOH的侧链保护肽缩合，得到结构为Fmoc‑EITTKDLKEKKEVVEEAEN‑Y的羧基保护的侧链保护肽；再脱去氨基Fmoc保护，得肽NH2‑EITTKDLKEKKEVVEEAEN‑Y；（3）采用液相片段缩合方法将肽NH2‑EITTKDLKEKKEVVEEAEN‑Y与结构为Fmoc‑SDAAVDTSS‑COOH的侧链保护肽缩合，产生结构为Fmoc‑SDAAVDTSSEITTKDLKEKKEVVEEAEN‑Y羧基保护的侧链保护肽，然后脱去氨基端Fmoc保护，并将氨基末端乙酰化，产生结构为Ac‑SDAAVDTSSEITTKDLKEKKEVVEEAEN‑Y羧基保护的侧链保护肽；或采用液相片段缩合方法将肽NH2‑EITTKDLKEKKEVVEEAEN‑Y与结构为Ac‑SDAAVDTSS‑COOH的侧链保护肽反应，产生结构为Ac‑SDAAVDTSSEITTKDLKEKKEVVEEAEN‑Y羧基保护的侧链保护肽；（4）将肽Ac‑SDAAVDTSSEITTKDLKEKKEVVEEAEN‑Y侧链保护肽的侧链和羧基去保护，得目标肽Ac‑SDAAVDTSSEITTKDLKEKKEVVEEAEN‑COOH；上述Y为叔丁酯基、苄酯基、对硝基苄酯基或三苯甲基。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王锐，常民，彭雅丽，薛宏祥，李明生，
申请(专利权)人：江苏施美康药业股份有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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