本发明专利技术公开一种胸腺四肽活性异构体及其制备方法，适用于工业化生产，化合物具有氨基酸序列Ｘ－Ａｒｇ－Ｌｙｓ－Ｙ－Ｖａｌ，Ｘ为乙酰基或氢，或任一序列与此氨基酸序列至少有７０％以上同源性；Ｙ为Ａｓｐ或Ｇｌｕ。胸腺四肽活性异构体，其结构为胸腺四肽氨基酸序列Ａｒｇ－Ｌｙｓ－Ａｓｐ－Ｖａｌ或Ａｒｇ－Ｌｙｓ－Ｇｌｕ－Ｖａｌ中的Ｌｙｓ或Ｇｌｕ被其相应的β－或γ－氨基酸取代的氨基酸序列。本发明专利技术还公开了上述异构体的医药用途，用于制备免疫调节药物、抗肿瘤药物和抗氧化药物。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术公开一种胸腺四肽活性异构体及其制备方法，同时还公开了其在制备免疫调节药物、抗肿瘤药物和抗氧化药物中的应用，属于生物制药
技术介绍
目前的生物技术已从胸腺激素中分离、纯化了几种胸腺肽，包括含有49个氨基酸残基的胸腺生成素II、由28个氨基酸残基构成的胸腺素α1和胸腺九肽等。天然序列胸腺三肽(TP-3)、四肽(TP-4)、五肽(TP-5)是胸腺生成素II的残基片段，文献报道它们仍具有胸腺生成素的活性。实验证明，胸腺肽在小肠可部分吸收，并能提高免疫功能。但胸腺五肽在体内易被各种酶类水解，如胰蛋白酶、羧肽酶、氨肽酶等，因此体内半衰期只有30秒。对于健康个体来讲，肽类激素在体内起到调节作用后迅速被清除是很正常的，但对于患者而言，需要给药治疗时，半衰期短对治疗不利。增强肽类激素的稳定性，延长它的半衰期以提高疗效，这是肽类激素的一个普遍需要解决的问题，所以改造肽类激素的结构、增加它们在体内的稳定性、提高生物利用度是本专利技术要解决的问题。
技术实现思路
本专利技术公开一种胸腺四肽活性异构体及其制备方法，适用于工业化生产。本专利技术还公开了上述异构体的医药用途，用于制备免疫调节药物、抗肿瘤药物和抗氧化药物。该专利技术公开的胸腺四肽活性异构体包括一项或多项下列特征化合物具有氨基酸序列X-Arg-Lys-Y-Val，X为乙酰基或氢，或任一序列与此氨基酸序列至少有70％以上同源性；Y为Asp或Glu。胸腺四肽活性异构体，其结构为胸腺四肽氨基酸序列Arg-Lys-Asp-Val或Arg-Lys-Glu-Val中的Lys或Glu被其相应的β-或γ-氨基酸取代的氨基酸序列。胸腺四肽活性异构体氨基酸序列表 本专利技术中异构体的制备方法以通常的Fmoc固相肽合成法合成。以氨基酸衍生物为原料，以二甲基甲酰胺(DMF)为溶剂，工艺过程包括溶胀—脱保护—偶联—脱保护偶联循环—切割。所说的溶胀是将接肽树脂和DMF加入柱反应器中，室温振摇，接肽树脂溶胀后抽干，用DMF洗涤后再抽干；所说的脱保护是脱去接肽树脂上的芴甲氧羰基(Fmoc)保护基，方法是在溶胀后的接肽树脂中加入脱Fmoc保护基溶液，室温振摇，抽干后用DMF洗涤再抽干；所说的偶联是向柱反应器中加入一种氨基酸衍生物和缩合剂，再加入DMF，避光室温振摇，反应0.3-20小时，抽干后用DMF振摇洗涤再抽干；所说的脱保护偶联循环是交替重复脱保护和偶联过程，偶联重复次数由短肽的链长决定，每次偶联所加入的氨基酸衍生物原料由短肽的组成决定，脱保护的重复次数比偶联重复次数多一次；所说的切割是脱氨基酸侧链保护基及从接肽树脂上裂解肽，即向抽干后的柱反应器中加入切割试剂，在(25--20)℃振荡(1-5)小时，过滤除去接肽树脂，滤液抽真空浓缩，浓缩液加入乙醚/石油醚振荡，置于(0--20)℃放置0.2-2小时，离心，倒去上清，沉淀真空干燥，得产品。上述工艺过程中，接肽树脂可以使用Fmoc-NH-SAL树脂、PAL树脂、Wang树脂、Fmoc-酰胺树脂。氨基酸衍生物可以是Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Asp(otBu)-OH、Fmoc-β-Asp-otBu、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Glu(otBu)-OH、Fmoc-γ-Glu-otBu、Fmoc-β-Lys(Boc)-OH、Fmoc-γ-Lys(Boc)-OH等。接肽树脂与氨基酸衍生物的摩尔比为1∶(2-5)。氨基酸偶联使用的缩合剂可以是苯并三唑-1-氧-三(二甲氨基)磷六氟磷酸盐(BOP)、1-羟基苯并三氮唑(HOBT)、N-甲基吗啉(NMM)，按摩尔比2∶(1-3)∶(2-6)混合制成；氨基酸衍生物与缩合剂按摩尔比为1∶(1--1.2)。切割试剂主要成分是三氟乙酸。脱Fmoc保护基溶液可以是(15-25)％的哌啶/DMF溶液；所说的用DMF振摇洗涤再抽干需要反复进行(5-8)次，每次振摇(2-6)分钟。为了得到纯品，在切割工艺过程之后，还需进行纯化过程。所说的纯化是采用高效液相色谱层析纯化，收集主峰。A泵溶液为0.1％的三氟乙酸水溶液，B泵溶液为0.1％的三氟乙酸、(60-80)％乙腈水溶液，进行梯度洗脱——以总流速(1-5)ml/分钟，在(10-60)分钟内，A泵流速由(100--60)％改变为(50-20)％，B泵流速由(0-40)％改变为(50-80)％，同时采用双波长监测，波长为214nm和385nm。本专利技术的积极效果在于对TP-4的结构进行了改造，设计了活性肽异构体，在TP-4原有结构的基础上，将其氨基酸序列中部分氨基酸用相应的β-、γ-氨基酸代替，所得改造结构后的活性肽在保持原有活性的基础上，大大提高其稳定性，延长体内半衰期，提高其生物利用度，这对肽类药物的开发将具有重要意义。通过测定它们的活性及体内外稳定性，对它们的药理、药效进行了研究。实验结果表明这些异构体在保持了原有活性的基础上稳定性大大提高。这一专利技术为胸腺肽活性机理的研究及新药开发提供了理论依据。本专利技术对胸腺四肽活性异构体的体外活性和和体外稳定性作了测定。人外周血淋巴细胞和猪胸腺T淋巴细胞的表面具有绵羊红细胞(SRBC)受体，简称为E受体，其使T细胞可与SRBC形成玫瑰花结，这是成熟T细胞的特征之一。细胞经45℃加热1h或用胰酶处理可脱去E受体。胸腺肽可以促进脱E受体的T细胞重新合成E受体，因此可用脱E受体的E花环实验来测定胸腺肽的活性。胸腺生成素能够增加T细胞在各种抗原或致有丝分裂原如ConA等激活后产生干扰素(IFN)、白细胞介素-2(IL-2)和白细胞介素-3(IL-3)等多种淋巴因子的分泌，增加T细胞表面淋巴因子受体的水平。淋巴细胞增殖实验是评估受检淋巴细胞功能的常用和主要指标，也是考核药物活性的有效手段。体外血浆中稳定性的测定 将样品在血浆中37℃进行酶解，然后用HPLC分析水解产物，并与正常结构进行比较，结果它们比正常结构半衰期均长。实验测定结果表明胸腺四肽活性异构体体外免疫活性保持或者高于胸腺五肽(TP-5)的水平。胸腺四肽活性异构体稳定性增强，半衰期大大提高。本专利技术对胸腺四肽活性异构体作了一般药理学实验，结果表明对动物神经系统、心血管系统和呼吸系统均无显著影响。本专利技术还对胸腺四肽活性异构体作了药效学实验，动物实验中显示具有显著的免疫增强作用、抗肿瘤作用和抗氧化作用。其效果比胸腺五肽(TP-5)的有显著提高。试验例1细胞增殖实验1、细胞悬液的制备昆明鼠取脾放入D-Hank’液中研磨释放T细胞，再用D-Hank’液洗涤三次，最后用IMEM培养基稀释至细胞浓度为2.5×107个/ml。2、反应体系取细胞100μl，样品(50μg/ml)50μl加入96孔板中，二氧化碳培养箱中作用4小时，加入ConA50μl作用44小时后，体系中加入MTT20μl作用4小时，2000转/分离心5分钟。加入DMSO振摇20分钟，酶标仪570nm比色，计算刺激率。细胞增殖实验结果 结论胸腺活性异构体LW401、LW402、LW403、LW404、LW405、LW406、LW407、LW408对细胞增殖的影响与TP-5相当或略高于TP-5。试验例2体外血浆中稳定性的测定为测定各异构体的体外稳定性，我们将样本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种胸腺四肽活性异构体，包括下列特征： 化合物具有氨基酸序列Ｘ－Ａｒｇ－Ｌｙｓ－Ｙ－Ｖａｌ，Ｘ为乙酰基或氢，或任一序列与此氨基酸序列至少有７０％以上同源性；Ｙ为Ａｓｐ或Ｇｌｕ；。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李惟，王丽萍，王丽凤，陈晓光，
申请(专利权)人：吉林大学，
类型：发明
国别省市：82[中国|长春]
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