本发明专利技术公开了固相合成胸腺肽α1的28肽阶段的缺失肽及检测方法；所述检测方法包括：将固相合成胸腺肽α1过程中获得的28肽采用LC/MS联用仪进行梯度洗脱获取离子流谱；如果所获取的离子流谱在19.64min时出现峰面积为6.21％的峰、在28.37min时出现峰面积为5.14％的峰、在30.84min时出现峰面积为1.63％的峰或在31.44min时出现峰面积为1.58％的峰；则说明固相合成胸腺肽α1的28肽阶段中含有缺失肽。本发明专利技术还公开固相合成胸腺肽α1的28肽阶段的缺失肽谱。本发明专利技术可有效保障和控制胸腺肽α1的质量，在制备高纯度固相合成胸腺肽α1中有重要应用价值。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及固相合成胸腺肽α I中的缺失肽及检测方法，尤其涉及固相合成胸腺肽α I的28肽阶段的缺失肽及检测方法，属于固相合成胸腺肽α I领域。
技术介绍
胸腺肽α I是从胸腺素组分5 (TF-5)中分离出的一种活性多肽，由28个氨基酸残基组成，分子量为3108.37。在TF-5中，胸腺肽α I的含量为0.6%，是人体胸腺激素的重要活性组分。例如胸腺肽α I可调节T淋巴细胞发育、分化和成熟。此外，胸腺肽α I能修复受损的T淋巴细胞。虽然从TF-5中分离的胸腺肽α I无明显毒副反应，但由人工固相合成的市售胸腺肽αI可因不纯而造成不良反应。目前，人工固相合成胸腺肽αI的操作规程千篇一律，几乎没有优化空间。市售的保护氨基酸和相关试剂的纯度也足以支持人工固相合成高纯度胸腺肽α 。在操作规程不出差错的前提下，人工固相合成的胸腺肽α I是否纯，取决于它含的缺失肽的状况。与小分子药物不同，多肽的生物活性非常强。在人工固相合成的胸腺肽α I中，SP使存在微量的缺失肽也可造成严重的毒副作用。控制人工固相合成的胸腺肽α I的质量的关键是控制缺失肽。目前国内外既没有披露人工固相合成的胸腺肽α I中的缺失肽状况，也没有公开测定人工固相合成的胸腺肽α I中的缺失肽的方法。这种状态不适应胸腺肽α I的临床地位。为了改善这种状 况，保障胸腺肽α I的临床用药安全性，形成了本专利技术。
技术实现思路
本专利技术的目的之一是提供一种能够准确、灵敏的检测固相合成胸腺肽α I的28肽阶段是否含有缺失肽的方法；本专利技术的另一个目的是提供固相合成胸腺肽α I的28肽阶段的缺失肽谱；本专利技术的目的之三是将固相合成胸腺肽α I的28肽阶段的缺失肽谱应用于胸腺肽α I固相合成中的质量控制。本专利技术的上述目的是通过以下技术方案来实现的:一种检测固相合成胸腺肽α I的28肽阶段是否含有缺失肽的方法，包括以下步骤:将固相合成胸腺肽α I过程中的28肽样品采用LC/MS联用仪进行梯度洗脱获取离子流谱；如果所获取的离子流谱在19.64min时出现峰面积为6.21%的峰、在28.37min时出现峰面积为5.14%的峰、在30.84min时出现峰面积为1.63%的峰或在31.44min时出现峰面积为1.58%的峰；则说明固相合成胸腺肽α I的28肽阶段中含有缺失肽。本专利技术所述的胸腺肽α I的氨基酸序列为SEQ ID N0.1所示。所述的梯度洗脱优选为:用0.1 %甲酸/乙腈进行梯度洗脱，所述的梯度洗脱的条件优选为流速为 0.4ml/min,梯度为:0-30min, 0.1% 甲酸 / 乙腈=90/10 ；30-40min, 0.1 %甲酸 / 乙腈=80/20 ；40min,0.1% 甲酸 / 乙腈=75/25。本专利技术方法中LC/MS联用仪中的LC采用Agilent 1200自动进样，WatersXterraRP18分析柱的规格为5 μ m，3.0X 150mm ；LC/MS联用仪中的MS采用BrukerSolatixFT-1CR-MS,离子流检测器。本专利技术进一步提供了固相合成胸腺肽α I的28肽阶段的缺失肽谱，其氨基酸序列分别为 SEQ ID N0.2、SEQ ID N0.3、SEQ ID N0.4 或 SEQ ID N0.5 所示。本专利技术所提供的缺失肽作为胸腺肽α I固相合成过程中的质量控制物应用于提高固相合成胸腺肽α I的质量或纯度。本专利技术方法可以准确、灵敏的鉴别出固相合成胸腺肽α I的11肽阶段是否含有缺失肽或非肽杂质，可以有效地保障和控制胸腺肽α I的质量，在制备高纯度固相合成胸腺肽α I中有重要应用价值。附图说明图1胸腺肽α I粗品的离子流。图2胸腺肽α I的质谱。图 3 胸腺妝 α I 中的缺失妝 Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-1le-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn 的质谱。图4甲酰化胸腺肽α I的质谱。图5甲酰化胸腺肽α I的质谱。图 6 胸腺妝 α I 中的缺失妝 Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-1le-Thr-Thr-Asp-Leu-Ly s-Glu-Ly s-Ly s-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn 的质谱。图 7 胸腺妝 α I 中的缺失妝 Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-1le-Thr-Thr-Asp-Leu-Ly s-Glu-Ly s-Ly s-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn 的质谱。图 8 胸腺妝 α I 中的缺失妝 Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Ser-Ser-Glu-1le-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Ly s-Glu-Ly s-Ly s-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn 的质谱。具体实施例方式下面结合具体实施例来进一步描述本专利技术，本专利技术的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本专利技术的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本专利技术的精神和范围下可以对本专利技术技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本专利技术的保护范围内。实施例1固相合成胸腺肽α I1.制备 Fmoc-Asn (Trt)-Wang Resin称取IOg (3.lmmol) Wang Resin置于固相反应合成柱中。加入60ml DCM溶胀树脂lOmin，抽走DCM。用DMF洗树脂三次，每次50ml，吹气两分钟，抽走溶剂。于磨口三角瓶中称取 5.5g(9.3mmol)Fmoc-Asn(Trt)和 1.38g(10.23mmol)HOBt，加入 50ml DMF 溶解。在冰水浴中冷却下加2.15ml (13.95mmol)DIC活化5min。将活化后的氨基酸加入用DMF洗好的树脂中，然后加入0.23g(1.86mm0l)DMAP，用氮气吹气进行搅拌，室温反应2-4h。反应结束后用DMF洗树脂三次，每次50ml，吹气两分钟，抽干溶剂。取少量树脂，用甲醇收缩三次,真空干燥至恒重，测替代值，如替代值达到预期，将树脂用乙酸酐封闭未反应的羟基，封闭反应2-4h后，用DMF洗树脂三次，每次50ml，吹气两分钟，抽走溶剂。用甲醇收缩树脂三次，每次50ml，吹气5min，抽走溶剂，真空干燥至恒重，测替代值。如替代值达到预期。2.Fmoc-Asn (Trt) -Wang Resin 的溶胀和脱 Fmoc上面得到的Fmoc-Asn(Trt)-Wang Resin并置于固相反应合成柱中，加60mlDCM溶胀lOmin，然后抽走DCM。用DMF洗涤树脂，每次用50ml DMF,每次洗2min，共洗三次。用浓度为20%的piperidine的DMF溶液脱Fmoc，共脱两次，每次50ml，一次脱3min，另一次脱8min。然后用DMF洗涤树脂，每次用50ml DMF洗2min，共洗四次。最后用DCM洗涤Asn (Trt)-Wang Resin，每次洗2min，共洗两次。抽本文档来自技高网...
【技术保护点】
检测固相合成胸腺肽α1的28肽阶段是否含有缺失肽的方法，包括以下步骤：将固相合成胸腺肽α1过程中获得的28肽采用LC/MS联用仪进行梯度洗脱获取离子流谱；如果所获取的离子流谱在19.64min时出现峰面积为6.21％的峰、在28.37min时出现峰面积为5.14％的峰、在30.84min时出现峰面积为1.63％的峰或在31.44min时出现峰面积为1.58％的峰；则说明固相合成胸腺肽α1的28肽阶段中含有缺失肽。
【技术特征摘要】
1.检测固相合成胸腺肽αI的28肽阶段是否含有缺失肽的方法，包括以下步骤:将固相合成胸腺肽α I过程中获得的28肽采用LC/MS联用仪进行梯度洗脱获取离子流谱；如果所获取的离子流谱在19.64min时出现峰面积为6.21%的峰、在28.37min时出现峰面积为5.14%的峰、在30.84min时出现峰面积为1.63%的峰或在31.44min时出现峰面积为1.58%的峰；则说明固相合成胸腺肽α I的28肽阶段中含有缺失肽。2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于:所述的胸腺肽αI的氨基酸序列为SEQID N0.1 所示。3.按照权利要求1所述的方法，其特征在于:所述的梯度洗脱为用0.1 %甲酸/乙腈进行梯度洗脱。4.按照权利要求1或3所述的方法，其特征在于:所述的梯度洗脱的条件为流速为0.4ml/min,梯度为:0_30min,0.1 % 甲酸 / 乙臆=90/10 ;30_40min,0.1 % 甲...
【专利技术属性】
技术研发人员：朱正兵，彭涛，王玲，张金花，
申请(专利权)人：海南合瑞制药股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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