一种聚乙二醇修饰的重组人白介素2的制备方法技术

本发明专利技术适用于生物医药领域，提供一种聚乙二醇修饰的重组人白介素2的制备方法，该方法包括以下步骤：用活化剂将mPEG活化，得mPEG活化分子；将该mPEG活化分子与重组人白介素2反应，然后加入甘氨酸溶液终止反应，将产物分离纯化，其中该活化剂选自：琥珀酸酐和N-羟基琥珀酰亚胺、对甲苯磺酸氯、N,N'-羰基二咪唑、N,N'-二琥珀酰亚胺基碳酸酯、对硝基苯碳酸酯、苯并三唑碳酸酯、苯基琥珀酰亚胺碳酸酯、乙酸-N-琥珀酰亚胺酯。本发明专利技术的制备方法操作简便，易于控制质量和放大生产。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物医药领域，尤其涉及。
技术介绍
白介素(interleukin)，白细胞介素的简称，是指在白细胞或免疫细胞间相互作用的淋巴因子，它和血细胞生长因子同属细胞因子。两者相互协调，相互作用，共同完成造血和免疫调节功能。白细胞介素在传递信息，激活与调节免疫细胞，介导T、B细胞活化、增殖与分化及在炎症反应中起重要作用。白介素一2即白细胞介素一2(interleukin-2，IL_2)，是白介素家族中的一员，又名T细胞生长因子，主要由活化的CD4+T细胞和CD8+T细胞产生，其具有广泛生物活性，可以作用于所有T细胞亚群。重组人白介素一 2(rhIL-2)，通常由原核表达载体表达，与白介素IL-2相比，重组人白介素_2在N末端多一个甲硫氨酸Met，其具有人白介素_2的主要功能，可促进T淋巴细胞增殖，激活淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK细胞)，促进β —干扰素的产生，对免疫应答 的产生和调节有重要作用，是目前调控免疫应答的重要因子，临床上已显示出具有较好的抗肿瘤活性。在用作外源蛋白质药物时，由于其具有不同于人白介素_2的结构，属于天然抗原，具有较强的免疫原性，反复注射会引发受试者的免疫反应，使得患者依从性较差。此外还会受到各种蛋白酶的攻击而容易失去生物活性，且生物半衰期短，无法充分发挥其生物活性，且为了维持其在体内有效的血药浓度，需要多次给药，导致患者依从性差，严重影响了其药理作用的发挥，限制了其临床应用。针对上述问题，研究人员采用了各种药物传递技术来提高其疗效，诸如采用不同的给药途径、不同的药物缓释控释技术、不同高分子材料的修饰等。而目前研究最为广泛和成熟的是聚乙二醇修饰技术。PEG具有良好的生物相容性，高度的亲水性，在水溶液中具有较大的水动力学体积，且无免疫原性。PEG修饰技术主要是通过PEG的端基活化后与蛋白药物或多肽上的残基基团进行反应形成PEG-蛋白偶联物。实验证明，PEG偶联的蛋白质药物或多肽可以延长蛋白质药物在体内的半衰期，降低其免疫原性和抗原性；另外还可以减弱蛋白酶的水解作用，增加蛋白分子的可溶性等。目前关于PEG修饰白介素-2的研究报道中，PEG的分子量大都采用5kDa IOkDa,所得到的偶联物是多修饰产物，均一性比较差，且活性损失较大，不易控制质量和放大生产。一般来说，分子量越小，在相同反应条件下的修饰率越高，对产物活性的影响也就越大。而采用分子量较大的PEG修饰时，由于会受到空间位阻作用，所得到的偶联产物将较为均一，且产物的活性损失也比较小。
技术实现思路
本专利技术实施例的目的在于提供，旨在解决PEG修饰重组人白介素2时出现的偶联产物均一性比较差，且活性损失较大的问题。本专利技术实施例是这样实现的，，包括以下步骤:用活化剂将单甲氧基聚乙二醇(mPEG)活化，得到单甲氧基聚乙二醇活化分子；将该单甲氧基聚乙二醇活化分子与重组人白介素2在pH为7.5^9.0的缓冲液中反应，然后加入甘氨酸溶液终止该反应，将反应产物分离纯化，其中该活化剂选自:琥珀酸酐和N-羟基琥珀酰亚胺、对甲苯磺酸氯、N，N’-羰基二咪唑、N，N’ - 二琥珀酰亚胺基·碳酸酯、对硝基苯碳酸酯、苯并三唑碳酸酯、苯基琥珀酰亚胺碳酸酯、乙酸-N-琥珀酰亚胺酯。本专利技术实施例还提供一种由本专利技术的方法制备的聚乙二醇修饰的重组人白介素2。本专利技术的制备方法采用大分子量的mPEG来修饰重组白介素_2上的氨基残基，该方法步骤简单，易于操作，合成效率高，易于控制质量和放大生产。通过本专利技术的制备方法制得的聚乙二醇修饰的重组人白介素2能够保留较高的抗病毒活性，同时与未修饰的rhIL-2相比，其免疫原性较低，体内半衰期延长，血清清除率低，无需多次给药，而且本专利技术制备的mPEG-rhIL-2，其分子量均一性较好。具体实施例方式为了使本专利技术要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。本专利技术实施例提供，包括以下步骤:SOl用活化剂将mPEG活化，得mPEG活化分子；S02将该mPEG活化分子与重组人白介素2在pH为7.5^9.0的缓冲液中反应，然后加入甘氨酸溶液终止该反应，将反应产物分离纯化。具体地，在步骤SOl中使用的单甲氧基聚乙二醇(MethoxyPolyethyleneGlycol),简称mPEG,是聚乙二醇的一种,具有良好的水溶性、润湿性、润滑性、生理惰性、对人体无刺激、性质温和。在优选实施例中，步骤SOI中使用的mPEG的分子量在IOkDa IOOkDa之间，进一步优选为IOkDa 50kDa之间，更优选为IOkDa 30kDa。该步骤SOl中，该活化剂选自琥珀酸酐和N-羟基琥珀酰亚胺、对甲苯磺酸氯、N, N’ -羰基二咪唑、N, N’ - 二琥珀酰亚胺基碳酸酯、对硝基苯碳酸酯、苯并三唑碳酸酯、苯基琥珀酰亚胺碳酸酯、乙酸-N-琥珀酰亚胺酯。 在优选实施例中，活化剂可选用琥珀酸酐和N-羟基琥珀酰亚胺混合物，此种情况下，还采用了吡啶作为催化剂。该优选实施例能显著提高步骤SOl中的活化反应速率。上述步骤SOl中的活化反应过程中，以摩尔量计，活化剂加入量略多于mPEG的加入量即可，或者采用更多量的活化剂。在优选实施例中，单甲氧基聚乙二醇活化分子与所述活化剂的摩尔比为1:2-1:20o通过上述步骤SOl中的活化剂活化后，可获得mPEG琥珀酰亚胺碳酸酯、mPEG-对甲苯磺酰氯、mPEG羰酰咪唑、mPEG琥拍酰亚胺琥拍酸酯、mPEG对硝基苯碳酸酯、mPEG苯并三唑碳酸酯、mPEG苯基琥珀酰亚胺碳酸酯、mPEG-琥珀酰酯乙酸酯等mPEG活化分子，这些mPEG活化分子分别与上述活化剂对应。这些mPEG活化分子与上述步骤S02中的重组人白介素2作用后使mPEG与重组人白介素2偶联,得到mPEG修饰的重组人白介素2,而上述活化剂游离出来，不与重组人白介素2结合。具体地，在上述步骤S02中，重组人白介素rhIL-2可从市场购得，也可利用大肠杆菌等原核表达载体重组表达获得，采用后一种方式获得时，其制备方法为本领域技术人员熟知。在优选实施例中，在上述步骤S02中，mPEG活化分子与重组人白介素2的反应在0-25°C反应，反应时间为2 24h。在优选实施例中，该步骤S02中mPEG活化分子与重组人白介素2的摩尔比为2:1飞0:1，在mPEG活化分子过量 的情况下便于使重组人白介素2分子充分偶联。在优选实施例中，在步骤S02中，上述该mPEG活化分子与重组人白介素2反应在磷酸盐缓冲液或硼酸盐缓冲液，该磷酸盐缓冲液或硼酸盐缓冲液PH为7.5-9.0,使用此种反应缓冲液便于后续的分离纯化操作，且分离纯化操作中使用的缓冲液与步骤S02偶联反应对应，即步骤S02中偶联反应与分离纯化均使用磷酸盐缓冲液或均使用硼酸盐缓冲液。在优选实施例中，在步骤S02中，所述甘氨酸溶液的浓度为0.5-0.6M，优选浓度为0.5M。经上述反应，mPEG与重组人白介素2偶联，可得到多种不同分子量的偶联产物，因此需要对粗产物进行分离和纯化。在优选实施例中，对粗产物进行分离和纯化处理是使用离子交换色谱进行分离，该分离过程中使用PH为5.(Γ8.0磷酸盐缓冲液或硼酸盐缓冲液，且该磷酸盐缓冲本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种聚乙二醇修饰的重组人白介素2的制备方法，包括以下步骤：用活化剂将单甲氧基聚乙二醇活化，得到单甲氧基聚乙二醇活化分子，其中，所述活化剂选自：琥珀酸酐和N?羟基琥珀酰亚胺、对甲苯磺酸氯、N,N“?羰基二咪唑、N,N“?二琥珀酰亚胺基碳酸酯、对硝基苯碳酸酯、苯并三唑碳酸酯、苯基琥珀酰亚胺碳酸酯、乙酸?N?琥珀酰亚胺酯；将所述单甲氧基聚乙二醇活化分子与重组人白介素2在pH为7.5~9.0的缓冲液中反应，然后加入甘氨酸溶液终止所述反应，将反应产物分离纯化。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：徐东，叶垚平，
申请(专利权)人：深圳市亚太兴实业有限公司，
类型：发明
国别省市：