本发明专利技术公开了一种突变hFGF-21蛋白成熟肽及其编码基因和应用，以及聚乙二醇修饰的突变hFGF-21蛋白成熟肽及其应用。本发明专利技术提供的突变hFGF-21蛋白成熟肽为序列表的序列3所示的蛋白质。本发明专利技术还保护所述蛋白质与聚乙二醇的偶联物，即将所述蛋白质进行聚乙二醇修饰。本发明专利技术提供的治疗糖尿病的药物具有良好的降血糖活性，特别是以所述偶联物为活性成分的药物，还具有稳定性高、半衰期长、免疫原性低等优点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种突变hFGF-21蛋白成熟肽及其编码基因和应用，以及聚乙二醇修饰的突变hFGF-21蛋白成熟肽及其应用。
技术介绍
糖尿病是血中胰岛素绝对或相对不足，导致血糖过高，出现糖尿，进而引起脂肪和蛋白质代谢紊乱，临床上可出现多尿、烦渴、多饮、多食，消瘦等表现，重者容易发生酮症酸中毒等急性并发症或血管、神经等慢性并发症。糖尿病是一种常见的内分泌代谢性疾病，1980年我国患病率为0.67%，上海统计1978-1989年患病率由1.01%上升为2.23%，其中增加主要是2型患者。以上事实说明，随着人们社会经济生活的提高，糖尿病(特别是2型)病人有迅速增加的势头不容忽视。2000年，Tetsuya Nishimura等人最先在小鼠胚胎中分离出FGF家族中的一个新成员并将其命名为成纤维细胞生长因子-21 (FGF-21)。FGF-21是成纤维细胞生长因子家族的一名新成员，主要在肝脏中表达，蛋白N端前28个氨基酸为信号肽(去除信号肽后的多肽为成熟肽)，因此FGF21可以分泌到细胞外。FGF-21具有调节血糖、降低血脂和改善胰岛素抵抗等作用，在医药领域有着广泛的应用前景。但长期的研究及临床实验结果显示，FGF-21与其他蛋白药物一样，稳定性差、体内半衰期短、易产生抗原抗体反应，这直接影响了其在临床上的治疗效果。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种突变hFGF-21蛋白成熟肽及其编码基因和应用，以及聚乙二醇修饰的突变hFGF-21蛋白成熟肽及其应用。本专利技术提供的突变hFGF-21蛋白成熟肽为序列表的序列3所示的蛋白质。编码所述蛋白质的基因也属于本专利技术的保护范围。所述基因具体可为如下I)或2)或3)或4)或5)的DNA分子:I)编码区如序列表中序列4自5’末端第I至546位核苷酸所示的DNA分子；2)序列表中序列4所示的DNA分子；3)在严格条件下与I)或2)限定的DNA序列杂交且编码具有相同功能的蛋白的DNA分子；4)与I)或2)限定的DNA序列具有90%以上同源性且编码具有相同功能的蛋白的DNA分子。所述严格条件为在0.1 XSSPE (或0.1XSSC)、0.1% SDS的溶液中，65°C条件下杂交并洗膜。本专利技术还保护所述蛋白质与聚乙二醇的偶联物，即将所述蛋白质进行聚乙二醇修饰(又称PEG化)。聚乙二醇修饰 是将活化的聚乙二醇通过化学方法偶联到蛋白质、多肽、小分子有机药物和脂质体上，从而增加具有药效的蛋白质的稳定性，延长其体内半衰期，降低免疫原性。本专利技术还保护所述偶联物的制备方法，包括如下步骤:在氰基硼氢化钠的作用下，所述蛋白质与mPEG-ALD反应,得到所述偶联物。所述反应中:所述蛋白质与mPEG-ALD的质量比具体可为1:4,所述反应具体可在pH6.0的朽1檬酸缓冲液中进行。所述反应的初始时刻，所述蛋白质的浓度可为2.0mg/ml。所述反应的初始时刻，氰基硼氢化钠的加入量可为10倍于mPEG-ALD的摩尔数。所述反应的温度具体可为4°C，时间具体可为8小时。所述mPEG-ALD的分子量为5kD到80kD，具体可为20kD_40kD。所述方法还可包括如下纯化步骤:取含有所述偶联物的反应液，用S印hadex G25脱盐并将PEG-mFGF_21成熟肽置换于脱盐缓冲液(pH8.0、20mM的Tris-HCl缓冲液),然后进行Capto Q阴离子交换层析。Capto Q阴离子交换层析的具体参数:XK16/26柱，柱高10cm，填充GE Capto Q阴离子交换树脂；洗脱液为A液、B液或A液和B液的混合物，A液为pH8.0、20mM的Tris - HCl缓冲液，B液为含IM NaCl的pH8.0、20mM的Tris - HCl缓冲液；洗脱过程，0_20min，B液在洗脱液中的体积比由0%线性上升至100%，流速为10mL/min，收集电导在3ms/cm到20ms/cm之间的过柱后溶液，即为PEG-mFGF-21成熟肽溶液。本专利技术提供的偶联物的制备方法，具有工艺简单、修饰率和回收率高的优点。所述蛋白质或所述偶联物可用于制备治疗糖尿病的药物。所述治疗糖尿病的效果体现为降低血糖浓度。本专利技术还保护一种治疗糖尿病的药物，其活性成分为所述蛋白质或所述偶联物。所述药物还包括其它药学上可接受的载体或辅料。所述药物中，除了所述活性成分外，可以添加药学上允许的赋形剂、填充剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、增效剂和添加剂等。所述药物的给药形态可为针剂(如粉剂、水剂、油剂)。所述制剂都可采用本领域技术人员熟知常用的制备方法而获得。所述药物的给药途径可为皮下注射、静脉注射或肌肉注射。所述治疗糖尿病的效果体现为降低血糖浓度。本专利技术提供的治 疗糖尿病的药物具有良好的降血糖活性，特别是以所述偶联物为活性成分的药物，还具有稳定性高、半衰期长、免疫原性低等优点。附图说明图1为实施例1的步骤三中上清液和沉淀进行12%SDS_PAGE电泳图。图2为实施例1的步骤三中融合蛋白溶液和mFGF-21成熟肽溶液的电泳图。图3为实施例1的步骤三中的亲和层析图谱。图4为实施例2中细胞活性检测的结果。图5为实施例2中体内活性检测的结果。图6为实施例3中修饰物的选择过程中的电泳图。图7为实施例3中pH选择和反应时间选择过程中的电泳图。图8为实施例3中mFGF-21成熟肽与mPEG-ALD的质量比和蛋白浓度选择过程中的电泳图。图9为mPEG-ALD与mFGF-21成熟肽的偶联示意图。图10为实施例5中分子量和纯度检测的结果。图11为实施例5中温度稳定性的测定结果。图12为实施例6中PEG-mFGF-21成熟肽的免疫原性的测定结果。图13为实施例7中PEG-m-FGF-21成熟肽体内稳定性的检测结果。图14为实施例8中PEG-mFGF-21成熟肽的体外细胞活性检测结果。图15为实施例9中PEG-mFGF-21体内生物学活性的检测结果。具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本专利技术，但并不限定本专利技术。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。FGF-21成熟肽如序列表的序列I所示，其编码基因如序列表的序列2所示。mFGF-21成熟肽如序列表的序列3所示，其编码基因如序列表的序列4所示。原核表达载体pSUMO (在文献中被称为“pHisSUMO”):参考文献:姜媛媛，尹成凯，李晋南，任桂萍，张薇，李德山.利用SUMO融合系统高效表达可溶性重组蛋白的研究.东北农业大学学报，2008, 39(10):57-62 ;李璐，尹成凯，李德山.高效表达可溶性重组蛋白表达载体——pHisSUM0.生物技术，2009, 19(3):11-14.。大肠杆菌Rosetta (DE3):北京全式金生物技术有限公司，目录号:0)801。SUMO蛋白酶I (具有His标签):制备方法见文献:傅俊华，王琪，尹杰超，刘铭瑶，李宁，姚文兵 ，任桂萍，李璐，李德山.融合蛋白GST-Ulplp在大肠杆菌中的高效可溶性表达及其活性鉴定.生物工程学报，2010，26 (6):837-842.。HepG2细胞(人肝癌细胞):上海艾研生物科技有限公司。db/d本文档来自技高网...
【技术保护点】
序列表的序列3所示的蛋白质。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李德山，叶贤龙，任桂萍，孙国鹏，刘铭瑶，
申请(专利权)人：哈尔滨博翱生物医药技术开发有限公司，
类型：发明
国别省市：
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