本发明专利技术公开了一种重组人促红素-CTP融合蛋白的生产工艺方法，其特点是重组工程细胞株的培养方式采用微载体悬浮灌注培养技术或无血清悬浮流加培养技术。本发明专利技术还公开了重组人促红素-CTP融合蛋白的纯化工艺，通过优化，获得简单工艺流程，以获得高纯度、高活性的重组人促红素-CTP融合蛋白。本发明专利技术还涉及重组人促红素-CTP融合蛋白在猴体内的代谢动力学研究以及在治疗大鼠肾性贫血上的应用。
【技术实现步骤摘要】
重组人促红素-CTP融合蛋白生产工艺及应用
本专利技术属于生物制药工艺领域。其具体涉及一种重组人促红素与人绒毛膜促性腺激素β亚基羧基末端肽的融合蛋白的一种生产工艺方法，包括该融合蛋白的重组工程细胞株的获得、细胞培养及蛋白纯化工艺方法以及重组人促红素-CTP融合蛋白在猴药代实验和对大鼠肾性贫血治疗上的应用。
技术介绍
EPO是一种主要由肾脏产生的糖蛋白，分子量约为35KD，是人体内调节红系造血的主要激素，在红系祖细胞的增殖、分化和成熟中起着重要的调控作用。目前我国对EPO需求量逐年递增，但是普通EPO存在体内半衰期短，患者给药次数频繁等问题。因此如何延长其体内半衰期，以降低给药频次，成为当前EPO药物的研究热点。目前常用的技术手段有三种，一是使EPO进行PEG化(专利号200880021159. 4)，二是通过氨基酸突变增加糖化位点(美国安进公司的Aranesp，已上市)，三是使其与一些大分子蛋白或高糖化片段相连形成融合蛋白，目前已有文献报道有EPO-FC (见专利申请号200880005733. 7)、EPO-HAS (见专利申请号 200410053319. 7)和 EP0-CTP 文献报道(((Development of a Long-Acting Erythropoietin by Fusing the Carboxyl-Terminal Peptide of Human Chorionic Gonadotropin_-Subunit to the Coding Sequence of Human Erythropoietin)))等。本专利技术所述的融合蛋白是参考上述专利及文献基础设计的，在EPO的羧基末端增加一段带有人绒毛膜促性腺激素β亚基的肽链。人绒毛膜促性腺激素(hCG)是胚胎滋养层细胞分泌的一类具有重要生理功能的糖蛋白激素，由两个不同的亚基α、β以非共价键连接组成，CTP短肽是人绒毛膜促性腺激素β亚基羧基末端肽。人绒毛膜促性腺激素β亚基羧基末端肽能够增加唾液酸含量，增加分子量，延长半衰期而不影响EPO蛋白活性，已有文献 艮道(《Development of a Long-Acting Erythropoietin by Fusing the Carboxyl-Terminal Peptide of Human Chorionic Gonadotropin_-Subunit to the Coding Sequence of Human Erythropoietin)))支持其可使 EPO 半衰期延长 2-3 倍。由于EPO为高糖化蛋白，其分子量的40%为糖，融合CTP短肽后其糖基化程度更高，因此EPO-CTP融合蛋白的生产也必须选用糖化修饰较完善的哺乳动物细胞表达系统。 重组糖蛋白类药物的生产目 前较成熟的生产表达系统为哺乳动物细胞表达系统，最常用的细胞系为中华仓鼠卵巢细胞(CHO)。目前哺乳动物细胞大规模培养方法可以分为贴壁培养、悬浮培养和固定化培养。贴壁培养是指细胞贴附在一定的固相表面进行单层培养。由于细胞固定于表面，不需要复杂的细胞截流装置，便于采用灌注培养。悬浮培养是指细胞在反应器中自由悬浮生长的过程。悬浮培养系统主要适用于非贴壁依赖性细胞培养。固定化培养是将动物细胞与水不溶性载体结合起来，再进行培养的一种方法。本专利技术中EPO-CTP融合蛋白的生产可采用两种细胞培养方式，即微载体贴附灌注培养和悬浮流加培养方式。其特点是采用剪切力小，传氧效果好的，混合方式为摇动式混合的激流式细胞生物反应器。第一种培养方式采用微载体贴附悬浮灌注培养，微载体可支持细胞高密度、长时间生长，且微载体悬浮于培养液内，可实现较高的传质传氧效率，此种培养方式可不断补充新鲜培养液、排出代谢废物、延长细胞表达时间，并且利用悬浮培养营养物质、溶解氧混合均匀的特点，从而提高重组蛋白产量，为一种新型实用的生产高糖化重组蛋白的方法。第二种培养方式为悬浮流加培养，主要是用于可以通过悬浮驯化并适应悬浮培养的细胞。悬浮流加培养工艺操作简单、可靠灵活，特别是利用激流式细胞生物反应器传氧效果好，一次性反应袋操作方便，可大大缩短培养周期，易于放大培养规模，通过工艺的简单控制，即可满足EPO-CTP生产需求。本专利技术对利用此种生产方法生产的融合蛋白在动物体内的应用进行了研究，融合蛋白在食蟹猴体内的药代实验数据显示出优于普通EPO的半衰期。在大鼠肾性贫血治疗上，融合蛋白可达到一周给药一次的长效作用。
技术实现思路
本专利技术所要解决的问题主要在于优化形成了一种重组人促红素-CTP融合蛋白的生产工艺方法，包括生产重组人促红素-CTP融合蛋白的重组工程细胞株的构建，并采用载体贴附灌注培养工艺或悬浮流加工艺及优化的蛋白分离纯化方法获得高活性、高纯度融合蛋白，经实验证明该融合蛋白在治疗过程中可达到减少给药频率的效果。本专利技术公开了一种重组人促红素与人绒毛膜促性腺激素β亚基羧基末端肽的融合蛋白的核甘酸序列及氨基酸序列。SEQ ID NO I 是 EP0-CTP 核甘酸序列CCG GAA iTC '丨 CCACC GGGGTGCACGAATGTCCTGCCTGGCTGTGGCTTCTCCTGTCCCTGCTGTCGCTCCCTCTGGGCCTCCCAGTCCTGGGCGCCCCACCACGCCTCATCTGTGACAGCCGAGTCCTGGAGAGGTACCT CTTGGAGGCCAAGGAGGCCGAGAATATCACGACGGGCTGTGCTGAACACTGCAGCTTGAATGAGAATATCACTGTCCCAGACACCAAAGTTAATTTCTATGCCTGGAAGAGGATGGAGGTCGGGCAGCAGGCCGTAGAAGTCTGGCAGGGCCTGGCCCTGCTGTCGGAAGCTGTCCTGCGGGGCCAGGCCCTGTTGGTCAACTCTTCCCAGCCGTGGGAGCCCCTGCAGCTGCATGTGGATAAAGCCGTCAGTGGCCTTCGCAGCCTCACCACTCTGCTTCGGGCTCTGGGAGCCCAGAAGGAAGCCATCTCCCCTCCAGATGCGGCCTCAGCTGCTCCACTCCGAACAATCACTGCTGACACTTTCCGCAAACTCTTCCGAGTCTACTCCAATTTCCTCCGGGGAAAGCTGAAGCTGTACACAGGGGAGGCCTGCAGGACAGGGGACAGATCTTCCTCTTCAAAGGCCCCTCCACCTAGCCTTCCATCTCCATCTCGACTCCCTGGGCCTTCTGACACCCCTATCCTCCCACAA |tgataa|( ja;C/C X 'Ge AAAAGGAAAA(方框为起始密码子和终止密码子；阴影斜体为EcoRI和Not I酶切位点)SEQ ID NO 2 是 EP0-CTP 氨基酸序列MGVHECPAWLWLLLSLLSLPLGLPVLGAPPRLICDSRVLERYLLEAKEAENITTGCAEHCSLNENITVP DTKVNFYAffKRMEVGQQAVEVffQGLALLSEAVLRGQALLVNSSQPWEPLQLHVDK本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种重组人促红素?CTP融合蛋白的生产工艺方法，其具体步骤包括：将含有编码重组人促红素?CTP融合蛋白基因的表达载体，采用适当的转化方法转化宿主细胞，通过优化筛选获得重组工程细胞株，并采用微载体悬浮灌注或无血清悬浮流加培养工艺方法进行细胞培养并收获细胞培养液，通过经过优化的纯化工艺流程来分离获得高纯度、高活性的重组人促红素?CTP融合蛋白。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王锐，张秀芹，孟庆勇，董敏，刘铁成，梁秋波，李会成，
申请(专利权)人：哈药集团技术中心，
类型：发明
国别省市：
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