本发明专利技术涉及一种dcf1基因的新用途。该基因能有效缓解运动能力和学习记忆能力下降的状况。本发明专利技术通过分析ClimbingAssay（爬壁实验）和LearningandMemoryAbilityAssay（学习记忆能力实验）的结果可以证实，表达人源dcf1基因后AD模型果蝇的运动能力和学习记忆能力下降的症状有了显著的缓解。这种利用在神经细胞内表达基因产物来治疗AD的方法，有别于传统的外部给药，为AD的治疗开辟了一条新的思路。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种dcfl基因的新用途。
技术介绍
阿尔兹海默症(Alzheimer’s Disease, AD)也就是我们俗称的老年痴呆,是一种大脑的退行性疾病，主要表现为进行性记忆和认知功能障碍。目前公认的阿尔兹海默症主要的病理改变是脑内β淀粉样斑块的形成和tau蛋白介导的神经纤维缠结。目前阿尔兹海默症的形成原因与发病机制仍然是全球的热点关注话题，这不仅是一门值得被关注值有待被解决的问题，更与人类健康息息相关。树突细胞因子(dentritic cell-derived factor 1,DCF1)基因的功能报道比较罕见。有报道指出DCFl能够抑制淀粉样前体蛋白APP的剪切，进而阻止形成阿尔兹海默症淀粉样蛋白斑的β淀粉体蛋白肽。此研究就是旨在探讨DCFl缺失后对蛋白质组的功能表达发生什么样的改变。果蚬(Drosophila melanogaster)具有高度发达的神经系统以及较短的生命周期，易饲养且易于进行遗传学、细胞生物学、分子生物学手段的操作和分析，是一种非常实用的模式生物。所有，果蝇广泛地用于神经退行性疾病模型的构建和研究。本专利技术通过GAL4/UAS双元系统控制外源基因表达，利用在果蝇神经细胞中表达表达人源APP和BACE来构建AD果蝇模型，该模型被证实在果蝇生命周期的早期即开始呈现运动能力下降的AD的症状。DIGE (双向荧光差异凝胶电泳)是在传统电泳的基础上发展起来的新型蛋白质定量技术。DIGE通常使用三种荧光染料(CY2，CY3，CY5)标记不同组别的蛋白(包括混合蛋白样本作为内参)。电泳分离后，根据不同波长进行激光扫描，运用专业分析软件得出确定的定量结果。
技术实现思路
专利技术目的之一在于提供一种dcfl基因在缓解运动能力下降症状中的应用。本专利技术的目的之二在于提供一种dcfl基因在缓解学习记忆能力下降症状中的应用。本专利技术通过杂交的方式在AD模型果蝇神经细胞中表达dcfl基因，利用ClimbingAssay (爬壁实验)检测其运动能力下降症状的缓解情况；另外通过分析野生型以及DCFl缺失后的小鼠全脑蛋白的2D-DIGE (双向荧光差异凝胶电泳)，以及质谱分析得出相关的表达差异蛋白，并对所有差异蛋白(P〈0. 05)进行功能注视及分类，归类3个蛋白为阿尔兹海默症(AD)相关蛋白并进行western的表达量验证。通过分析open field (认场实验)和Morris water maze (水迷宫即学习记忆能力实验)的结果可以证实,dcfl基因缺失后的小鼠的运动能力和学习记忆能力都有所下降。本专利技术通过分析Climbing Assay (爬壁实验)和 Learning and Memory AbilityAssay (学习记忆能力实验)的结果可以证实，表达人源dcfl基因后AD模型果蝇的运动能力和学习记忆能力下降的症状有了显著的缓解。这种利用在神经细胞内表达基因产物来治疗AD的方法，有别于传统的外部给药，为AD的治疗开辟了一条新的思路。附图说明图I为构建的果蝇转基因载体pUAST-dcf I经限制性内切酶EcoRI和XbaI双酶切产物的电泳图，最左边泳道为DNA Marker，泳道1、2均为pUAST_dcfl双酶切产物。图2为显微注射操作时果蝇的受精卵的状态。图3为显微注射得到带有平衡基因的人源dcfl转基因果蝇和Double Balance果蝇以及野生型果蝇wlll8分别杂交后获得的纯合UAS系转基因果蝇品系w;UAS-dcn/以5-如€1;+/+、以及野生型果蝇《1118分别和elav-GAL4果蝇(泛神经细胞表达启动)杂交得到的Fl代果蝇，分别提取羽化后10天Fl代果蝇脑部组织的总RNA后反转录cDNA为模版而进行的PCR反应后的电泳图(引物为构建转基因载体pUAST-dcf I时取得目的片段时的引物)，内参为β-actin。图4为果蝇爬壁实验结果。实验的四组果蝇分别为AD模型果蝇、共表达dcfl的AD模型果蝇、表达dcfl的果蝇、野生型(这些UAS系果蝇和elav-GAL4杂交产生Fl代以表达各外源基因，野生型果蝇与elav-GAL4杂交作为对照)。图片显示从成虫羽化第I天起到第60天，每隔10天进行一次爬壁能力的测定的结果。统计显著性的方法为Student’ sTest，*ρ〈0· 05，** ρ〈0·01。图5为果蝇学习记忆实验结果。实验的四组果蝇分别为AD模型果蝇、共表达dcfl的AD模型果蝇、表达dcfl的果蝇、野生型果蝇wl118 (这些UAS系果蝇和elav_GAL4杂交产生Fl代以表达各外源基因，野生型与elav-GAL4杂交作为对照)。图片显示果蝇进入可食管和不可食管的数量变化，通过果蝇寻找食物的时间和数量变化可以判断果蝇学习记忆能力的变化。A为各组果蝇在进入可食管的数量变化图；B为各组果蝇进入不可食管的数量 变化图。统计显著性的方法为Student’ s Test, *ρ〈0· 05, ** ρ〈0. 01。图6为用PCR手段鉴定小鼠基因型的凝胶电泳图。其中分别用up low以及upF31ow两对引物进行PCR检测。1，2泳道的检测结果为400bp以及I. 9kb为野生型；3，4泳道的检测结果为没有条带与700bp为敲除型。图7为蛋白质的2D电泳图，将鉴定完毕的小鼠包括野生型和敲除型的小鼠各5只取脑组织的蛋白，混合后上样，根据蛋白质大小及等电点的分离形成二维的电泳图。图8为western验证差异蛋白的表达量。对于野生型和全敲鼠的全脑蛋白进行抽提，并将其进行western定量，验证了质谱分析结果。图9为小鼠进行了阿尔兹海默症模型鼠的行为学测试。首先进行学习记忆能力的测试，测试手段为水迷宫。对其进行5天的训练，然后测试其的学习记忆。分别记录小鼠的游行距离，其穿越平台的次数与时间，并对结果进行Student’ s T test的统计分析，其中(*ρ〈0· 05, **ρ〈0· 01) 图10为小鼠进行运动能力的测试，开场实验可以检测小鼠的运动能力，同时也能测试小鼠对于新奇事物的探索能力。参数记录分别为小鼠运动的全程距离，穿越中间区域的次数以及停留在中央区域的时间。具体实施例方式本实施例所用的表达dcfl的果蝇模型的建立方法如下 一、果蝇转基因载体pUAST-dcfl的构建和验证 I、为得到果蝇转基因载体pUAST-dcf I，首先以人子宫颈癌细胞HeLa细胞的cDNA为模版进行 PCR 扩增，引物为 dcfl primers (5，-CGGAATTCATGGCGGCGCCGAAGGGG AG-3’和 5’ -GCTCTAGATTAAATTTCAGAATGAGCAA-3’)，得到大小为972bp (dcfl基因开放式阅读框全长)的目的片段后再用EcoRI和XbaI双酶切，收集片段备用。2、然后用EcoRI和XbaI双酶切空载体质粒pWIZ，收集大片段备用。3、最后将两个片段连接起来，得到果蝇转基因载体pUAST-dcfl。4、如图1，EcoRI和XbaI双酶切鉴定构建的果蝇转基因载体pUAST-dcf 1，可见转基因载体pUAST-dcf I双酶切后放出了大小为972bp的目的片段，后经测序证明了目的片段的准确性，说明正确的目的片段已经插入到载体中，载体构建成本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种dcf1基因在缓解运动能力下降症状中的应用。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：文铁桥，李璟，
申请(专利权)人：上海大学，
类型：发明
国别省市：
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