一种增强嫁接植物病毒抗性的方法技术

本发明专利技术公开了一种增强嫁接植物病毒抗性的方法，该方法包括：（1）番茄播种，播种前经无菌水浸润5~8小时后于培养箱中催芽；（2）切子叶预培养；（3）将根癌农杆菌侵染预培养过的叶盘外植体，进行共培养；（4）将根癌农杆菌侵染后的子叶转入培养基C中分化出芽；（5）促分化培养；（6）生根培养；（7）田间培养。本发明专利技术方法可缩短出芽1周左右，且出芽整齐，分化效率高，可有效防止假阳性，能有效促进正常芽的分化与生长。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及植物转基因技术及其应用，特别是一种使番茄接穗品种获得病毒抗性的方法及RNA干扰载体与转基因方法。
技术介绍
植物病毒是导致果树、蔬菜、花卉等园艺植物产量下降和品质变劣的重要原因， 在农业生产中病毒病是仅次于真菌的第二大类病害，由于防治困难，素有“植物癌症” 之称。目前植物病毒常用的防治措施有消灭病毒源和传统媒介、应用脱毒技术、药剂防治与选育抗病品种等，其中选育抗病品种是防治病毒病害最有效、最经济的方法。RNA干扰技术为基础的植物抗病技术因其高效性、特异性等特点，在植物抗病毒育种上展现了可观的前旦-5^ O基因沉默或称RNA干扰(RNA interference ；RNAi)是指由于转基因序列或外侵病毒与被沉默的内源或外源基因序列具有高度的同源性，其转录产物形成双链 RNA (double-stranded RNA, dsRNA)结构，从而特异性地降解同源祀基因mRNA,使之发生沉默(Fire A. , Xu S. , Montgomery Μ. Κ. , et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans . Nature, 1998，391(6669) :806-811)。由于其干扰作用是发生在靶基因的转录后水平，因此，也成转录后基因沉默(post-transcriptional gene silencing ;PTGS)。植物RNAi 具有特异性、高效性、系统性以及可遗传性等特点。可利用RNAi技术进行基因功能研究；或直接利用RNAi 创造的特殊性状变异体进行植物改良。其中RNAi技术在植物病毒抗性方面取得了很好的研究成果。RNAi是真核生物中普遍存在的外源核酸( 如病毒)入侵的防御机制，同时现有研究进一步表明病毒产生交叉保护是由于诱导病毒(弱株系)所产生的RNA沉默降解了具有致病性的同源病毒(强株系)的结果(Frank G. R. , Stuart A. M. and David C. B. Gene Silencing without DNA: RNA-Mediated Cross-Protection between Viruses. Plant Cell, 1999，11: 1207-1216)。利用RNAi抵抗病毒的常用策略是选择一段植物病毒基因的序列，以反向重复序列的方式构建成转录后含发夹结构的双链RNA(hairpin RNA,hpRNA) 或含内含子的ihpRNA (intron-hairpin RNA)表达载体,通过基因枪、病毒载体转染或者农杆菌介导转化整合到植物基因上，体内表达dsRNA，直接或间接诱导RNAi的产生，起到抵抗病毒的目的。而在发夹结构研究中，认为ihpRNA表达载体比hpRNA表达载体沉默效率高(Helliwell C， Waterhouse P. Constructs and methods for high-throughput gene silencing in plants . Methods, 2003, 30 (4) :289-295)。园艺植物种类与品种繁多，通过营养繁殖途径繁衍的园艺植物后代普遍经受着病毒的威胁。目前生产中栽培的众多蔬菜，水果和花卉均有几十到上百个品种，几乎每个品种都有数种到数十种病毒病害，病毒病抑制了植物的生长、结果，降低了果品的产量、质量，甚至引起死树，植物一旦被病毒侵染，将终生带毒持久受害。利用基因工程技术针对每一个品种进行改良，提高其抗病毒的能力，虽可行但需花费大量的人力与财力。嫁接是许多园艺植物繁殖的方法之一，绝大多数的果树和部分蔬菜采用嫁接繁殖。嫁接既能保持接穗品种的优良性状，又能利用砧木的有利特性。在应用嫁接繁殖时，一般同一种类中的不同品种采用同一砧木，甚至有些同属中的不同种类也采用同一砧木。这样一砧多用的情况，使得改良砧木品种比单独改良接穗品种要高效的多。所谓植物系统性基因沉默是指dsRNA、aberrant RNA或siRNA等基因沉默信号既可以通过胞间连丝进行的短距离传递，也可以通过植物中的维管系统长距离传递(BiOsnan C. A. , Mitter N. , Christie M. , et al. Nuclear gene silencing directs reception of long-distance mRNA silencing in Arabidopsis. Proc Natl Acad Sci USA, 2007，104(37):14741-14746)，(Kalantidis K. , Schumacher H. T. , Alexiadis T., et al. RNA silencing movement in plants. Biol Cell, 2008, 100 (I):13-26), 并诱导整个植物产生系统沉默。Daniel H.等(Daniel H. C，Fabio T. S. , Miya D. Η, et al. Pattern formation via small RNA mobility . Genes & Dev, 2009, 23: 549-554)研究表明小分子RNA可以作为一种移动的信号分子参与植物发育的调控。关于沉默信号在植物中的传递方向存在着不同的报道。Palauqui等(Palauqui J. C.，Elmayan T. , Pollien J.M. , et al. Systemic acquired silencing: transgene-specific post-transcriptional silencing is transmitted by grafting from silenced stocks to non-silenced scions , EMBO J, 1997，16 (15) :4738-4745.)以烟草为试材，发现 PTGS的传导是单方向的，即只能从沉默的站木传向非沉默的接穗；而Sonoda等(Sonoda S. and Nishiguchi M. Graft transmission of post-transcriptional gene silencing: target specificity for RNA degradation is transmissible between silenced and non-silenced plants, but not between silenced plants . Plant J, 2000, 21(1) :1-8)研究表明，PTGS的传导是双方向的，从砧木到接穗或从接穗到砧木都可传导， 但是PTGS从接穗到砧木的传导效率明显低于从砧木到接穗的传导。李明等(李 明，姜世玲，王幼群，等.转录后沉默信号可以在拟南芥嫁接体内快速双向传递.科学通报，2006，51 (2) : 142-147)的结果表明，无论用RNAi型植株作为砧木或接穗，基因沉默信号均能导致相应野生型接穗或砧木中靶基本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种制备转基因番茄砧木的方法，包括如下步骤：（1）番茄播种，番茄的种子播种前经无菌水浸润5~8小时后于培养箱中催芽；（2）切子叶预培养，在真叶未出现前，子叶刚冒出种皮且未完全展开时，将子叶两端切除1?2mm，再从中间横切一刀，每个子叶切成两块，进行预培养；（3）将根癌农杆菌侵染预培养过的叶盘外植体，进行共培养；其中根癌农杆菌含有对卡那霉素抗性基因标记的载体；（4）将根癌农杆菌侵染后的子叶转入培养基C中，叶背朝上光照培养，待愈伤上芽点出现，将带芽点外植体转入C1培养10~14d，分化出芽；其中，培养基C中：pH?6.0，Medium?Base?+2mg/L反式玉米素核苷+?200mg/L特美汀?+100mg/L卡那霉素；培养基C1中：pH?6.0，Medium?Base?+1?mg/L反式玉米素核苷?+80?mg/L卡那霉素?+200?mg/L特美汀；（5）促分化培养，待再生芽长出后切去白化外植体部分将抗性芽转入培养基C3中：pH?6.0，Medium?Base?+0.5?mg/L反式玉米素核苷?+1.5?mg/L?3?吲哚乙酸+80?mg/L卡那霉素+?200?mg/L特美汀；（6）生根培养，待抗性芽茎部长至1cm后，剔除愈伤组织，切下置入培养基D中生根培养15~30d，培养基D为：pH?6.0，Medium?Base?+2mg/L吲哚丁酸+?200mg/L特美汀；（7）田间培养：移栽至大田。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：杨国顺，白描，钟晓红，熊兴耀，邓子牛，石雪晖，陈文婷，周敏，
申请(专利权)人：湖南农业大学，
类型：发明
国别省市：