重组人胰岛素的制备方法及其产品技术

本发明专利技术公开了一种由人胰岛素前体制备人胰岛素的方法，包括以下步骤：（1）在水相缓冲液中将人胰岛素前体进行酶切反应得到B链第30位缺少苏氨酸的人双链胰岛素前体desB30；（2）在有机相中将双链人胰岛素前体desB30进行转肽反应得到胰岛素酯；（3）将胰岛素酯脱酯，即得。本发明专利技术方法方法相比于现有的将人胰岛素前体一步转化成人胰岛素酯的方法，转肽效率有显著提高，转肽反应时间大幅缩短，副产物少，整体收率更高，成本更低。本发明专利技术对于规模化、工业化利用毕赤酵母表达生产重组人胰岛素提供了一种简捷、高效的方法。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种重组人胰岛素的制备方法，尤其涉及一种将毕赤酵母表达的胰岛素前体转化为重组人胰岛素的方法以及由该制备方法得到的重组人胰岛素产品，属于重组人胰岛素的制备领域。
技术介绍
随着人们生活水平的提高，社会老龄人口增多，糖尿病的发病率在逐年上升。糖尿病是一种由遗传和环境因素相互作用而引起的临床综合症，其基本病理特征为绝对或相对性胰岛素分泌不足所引起的代谢紊乱。糖尿病现已成为一种常见病、多发病，是一种严重危害人类健康的疾病。防治糖尿病已成为临床上重要的、紧迫的医疗保健问题之一，日益为人们所重视。对于胰岛细胞病变，不能分泌胰岛素，需要补充外援胰岛素，相关的并发症也比较多的I型糖尿病患者而言，胰岛素是唯一的治疗药物。此外，还有30% 40%的II型糖尿病患者虽然自身能够分泌胰岛素，但由于分泌量不足或者不能有效地利用胰岛素，最终也需要使用胰岛素来治疗。胰岛素制品现已占到了整个糖尿病用药30%以上的市场份额。目前中国已取代印度成为全球糖尿病第一大国，2010年糖尿病患者已达9200万人，加之中国糖尿病患者整体治疗率不足三成且人均胰岛素使用量偏低，仅为美国糖尿病患者人均使用量的0.8%，所以中国胰岛素市场潜力巨大。因此，开发生产重组人胰岛素的新途径、优化现有胰岛素的生产手段一直是医药生物化学领域的一个重要课题。业界周知，基因工程生产人胰岛素的工业化要求相当高。其一，胰岛素是一个比较复杂的小分子，生产过程复杂。现在上市的基因工程重组人胰岛素主要有2种生产方法，分别为礼来公司的大肠杆菌表达与诺和诺德公司的酵母表达。前一种方法得到的胰岛素前体需要经过收率较低的复性操作和价格较贵的胰蛋白酶及羧肽酶的双酶切；后一种方法需要将表达的前体进行成本很高的酶切转肽反应。另外，两种方法都需要高效液相色谱进行精细纯化，生产成本和复杂程度远高于像干扰素等普通的基因工程产品。其二，该药品临床使用剂量较大，约是干扰素临床使用剂量的300倍。其三，价格便宜。作为第一个上市的基因工程产品已经问世20多年，而从动物胰脏提取的胰岛素上市已有80年的历史，事实上由于长期的技术和价格的竞争，胰岛素已经成为国际上最便宜、用量最大的基因工程药品。这使得该产品的工业化生产要达到规模大、成本低、工艺非常成熟才能实现盈利。巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)是目前应用最广泛的外源蛋白表达系统之一。该表达系统同时兼有原核表达系统和真核表达系统的优点，培养操作容易，生长快速，表达量高，又能对外源真核基因进行正确翻译和翻译后的加工与修饰，且对许多蛋白质产物进行分泌表达，使得产物易于提纯。另外，毕赤酵母又具有分泌效率高，产物不会过度糖基化，蛋白抗原性低，表达菌株因重组质粒融合到菌体基因组中不易丢失等优点。因此近十年来受到广大研究者的青睐。利用毕赤酵母进行胰岛素前体的表达一直是近年来生物制药一个执占。 I ;、、w、、、o 据谢婦、刘海峰等(PreparativeBiochemistry &Biotechnology. 2008, 38:308-317)报道,毕赤酵母表达的胰岛素前体在16L的微生物发酵罐上的表达量可达3. 6g/L。发酵液经离心、离子交换纯化、脱盐冻干后，胰岛素前体在有机相中利用过量的叔丁醚苏氨酸叔丁酯在胰蛋白酶的作用下，直接酶切转肽生成了在B链第30位添加了苏氨酸的insulin酯。这个insulin酯经三氟乙酸脱保护并经高效液相层析后，得到了与人胰岛素结构一致的重组人胰岛素。然而，用毕赤酵母表达生产重组人胰岛素，最为关键的步骤之一是酶切转肽。该步骤最明显的特征是转化慢、收率低、成本高。要得到有竞争力的产品，关键的指标之一是酶切转肽的收率要高，成本要低。酶切转肽过程实际包括两个反应，第一个反应是用胰蛋白酶将胰岛素前体酶切，共需要切三次，才能生成B链第30位缺少苏氨酸的双链胰岛素前体desB30。第二个反应是生成的desB30仍在胰蛋白酶的作用下，在B29赖氨酸的C末端转肽接入一个叔丁醚苏氨酸叔丁酯。已报道的文献中，酶切转肽的两步反应过程都是在有机相中一步进行，如二甲胺、1，4-丁二醇等。为保证较高的转肽效率，价格昂贵的叔丁醚苏氨酸叔丁酯与desB30的摩尔 比要超过或接近100倍。但在较高浓度的有机相中，胰蛋白酶的活性明显降低，所以转肽反应中的胰蛋白酶与前体的质量比例大约为I :5，甚至比例更高，最终导致胰酶的用量也很大，成本也较高。另外，酶切转肽反应速度很慢，一般10至24小时，至少10小时以上。反应时间长后，副产物会增多，会增加下游纯化的难度，同时也不利于整体收率的提高。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是克服现有的由胰岛素前体制备人胰岛素酯的方法中所存在的转肽效率低、产量收率低、副产物多或成本高等缺陷，提供一种新的人胰岛素的制备方法，该方法的转肽效率高，副产物少，产品收率高，成本低，该方法适宜规模化生产重组人胰岛素。本专利技术所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的一种由人胰岛素前体制备重组人胰岛素的方法，包括以下步骤(1)在水相缓冲液中将人胰岛素前体进行酶切反应得到B链第30位缺少苏氨酸的人双链胰岛素前体desB30 ；(2)在有机相中将双链人胰岛素前体desB30进行转肽反应得到胰岛素酯；(3)将胰岛素酯脱酯，即得。步骤(I)中所述的水相缓冲液优选为三羟甲基氨基甲烷缓冲液(Tris缓冲液)或碳酸氢铵缓冲液(NH4HCO3缓冲液);为了达到更好的效果，所述的Tris缓冲液优选为浓度为25-100mM、pH值为I. 0-8. 5的Tris缓冲液；更优选为浓度为50mM、pH值为8. 0的Tris缓冲液。所述的NH4HCO3缓冲液优选为浓度50-200mM，pH值为7. 0-8. 5的NH4HCO3缓冲液。步骤(I)中用胰蛋白酶对胰岛素前体进行酶切；所加入的胰蛋白酶与胰岛素前体的质量比优选为I :100 400，更优选为I :200。步骤(I)中所述的酶切反应时间优选为2. (T4. 0h，更优选为3. Oh。步骤(I)中所述的酶切反应温度优选为20_30°C，更优选为25°C。本专利技术中所述的“人胰岛素前体”可以是任意一种采用基因工程所表达或制备的胰岛素前体，例如可以是采用毕赤酵母或酿酒酵母菌株进行分泌表达的胰岛素前体。采用毕赤酵母菌株分泌表达胰岛素前体为本领域的常规技术，已为多种文献所报道(李军等，表达人胰岛素前体的毕赤酵母菌株的构建.北京化工大学学报.2004，第31卷第2期.21-23 ；郝贺龙等，人胰岛素B27K-DTr I前体在毕赤酵母中表达条件的优化.食品与药品.2011年第 13 卷第 09 期 305-308)。步骤(2)中所述的转肽反应为在胰蛋白酶的作用下，在双链胰岛素前体desB30的B29赖氨酸的C末端转肽接入一个叔丁醚苏氨酸叔丁酯。具体的，所述的转肽反应可参考以下方法进行将desB30和叔丁醚苏氨酸叔丁酯用二甲基亚砜(DMSO)溶解后，再依次加入1，4-丁二醇，Tris缓冲液，最后加入胰蛋白酶进行反应；所述的Tris缓冲液优选是浓度为0. 5M、pH值为6. 5的Tris缓冲液；DMS0、Tris 和 1，4_ 丁二醇的体积比优选为 15:15:70 ；步骤(2)双链胰岛素前体des本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种由人胰岛素前体制备重组人胰岛素的方法，包括以下步骤(1)在水相缓冲液中将人胰岛素前体进行酶切反应得到B链第30位缺少苏氨酸的人双链胰岛素前体desB30 ；(2)在有机相中将双链人胰岛素前体desB30进行转肽反应得到胰岛素酯；(3)将胰岛素酯脱酯，即得。2.按照权利要求I所述的方法，其特征在于步骤(I)中所述的水相缓冲液为三羟甲基氨基甲烷缓冲液或碳酸氢铵缓冲液。3.按照权利要求2所述的方法，其特征在于所述的三羟甲基氨基甲烷缓冲液的浓度为25 100mM、pH值为7. 0^8. 5 ;优选的，所述的三羟甲基氨基甲烷缓冲液的浓度为50mM，pH值为8. 0 ;所述的碳酸氢铵缓冲液的浓度为5(T200mM，pH值为7. 0^8. 5。4.按照权利要求I所述的方法，其特征在于步骤(I)中用胰蛋白酶对胰岛素前体进行酶切。5.按照权利要求4所述的方法，其特征在于所加入的胰蛋白酶与胰岛素前体的质量比为I :100 400，优选为I :200。6.按照权利要求I所述的方法，其特征在于步骤(I)中所述的酶切时间为2.(T4. Oh,优选为3. Oh ;所述酶切反应温度为...

【专利技术属性】
技术研发人员：秦玉峰，张元兴，尤金花，周祥山，解福生，刘海峰，顾建军，
申请(专利权)人：山东阿华生物药业有限公司，华东理工大学，山东东阿阿胶股份有限公司，
类型：发明
国别省市：