利用固定化酶从花生饼粕中生产活性肽的方法技术

本发明专利技术属于花生蛋白深加工技术领域，具体涉及一种利用固定化酶从花生饼粕中生产活性肽的方法，具体为：采用化学改性的磁性壳聚糖微粒固定碱性和中性两种蛋白酶，以此进行酶法水解，离心、脱色、纳滤脱盐、超滤分级、喷雾干燥获得花生活性肽。较传统制备方法，该方法具有生产成本低、生产周期短、产品得率高、纯度高、生产工艺具有温和、绿色、节能等特点。采用本发明专利技术方法生产出的花生功能肽除了具有良好的溶解性外，还具有降血压和抗氧化功能，因此具有广阔的市场开发价值。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术方法涉及花生副产物的深加工
，具体涉及ー种花生活性肽的酶法制备エ艺，是以花生饼柏为原料，利用化学改性的磁性壳聚糖微粒固定复合蛋白酶水解，从而获得花生活性肽的方法。
技术介绍
花生是世界上种植的主要农作物之一。我国是花生的生产大国，花生产量常年稳居世界首位，花生年产量在1400万吨左右。花生营养丰富，富含优质蛋白和油脂，脂肪含量在44 一 50%，蛋白质含量在24 — 34%，且含有多种维生素和矿物质。花生蛋白含有人体所必需的8种氨基酸，消化性可达99%，是营养价值高且资源丰富的植物蛋白资源。由于花生营养丰富且风味独特，所以深受我国人民的喜爱。目前，花生除一部分用于食品加工以外，50%以上的花生用于榨油。由此，我国每年产生数百万吨的蛋白含量大于50%的花生饼柏。由于我国花生深加工技术和产业化水平低，花生饼柏中蛋白的利用有限，大量的花生饼柏用作动物饲料或肥料，产品附加值低，资源浪费严重。因此，有必要开展花生饼柏中蛋白深加工方面的研究。生物活性肽是通过酶法水解、化学改性或物理作用得到的具有特殊生理功能的肽类。生物活性肽具有的生理功能有抗氧化、调节血压、促进微量元素吸收、调节免疫、调节睡眠等功效。与化学药物相比，生物活性肽具有毒副作用小、功效平缓、成本低等优势，因此国内外已经有活性肽药品、保健品上市，并得到了消费者的认可。研究表明，花生蛋白采用酶法水解具有显著的抗氧化、降低血压功能，研究花生饼柏制备花生活性肽有利于开发花生饼柏这一潜在的蛋白资源，生产高附加值的蛋白产品。目前，花生蛋白生产活性肽的エ艺主要有化学处理和酶法水解两大类。化学处理会降低花生肽的品质，且生产过程中产生的酸碱废液污染环境，这限制了化学处理的发展。采用酶法水解花生蛋白时，蛋白酶成本较高，单ー酶水解蛋白有限，且酶在热、酸碱及有机溶剂中不稳定，这也限制酶法制备花生活性肽的エ业化转化。固定化酶技术虽然一定程度上提高酶的利用率，但是酶解效果不佳。主要是酶与载体结合后，形成空间位阻阻碍酶与底物的結合，同时，加入的化学交联剂也会影响酶活。因此，提高酶稳定性、回收率和酶解效率是酶法生产活性肽エ艺中需要解决的难题。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供ー种利用固定化酶从花生饼柏中生产活性肽的方法，采用该方法所得花生活性肽纯度高且活性好。为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案如下 ー种利用固定化酶从花生饼柏中生产活性肽的方法，其包括如下步骤 O制备化学改性的磁性壳聚糖微粒在碱性条件下，将壳聚糖粉末与环氧氯丙烷混合后于50-70°C搅拌反应1-2 h，然后加入ニ胺化合物继续反应I. 5-2. 5 h，反应结束后固液分离，取固体备用，投料比按照每Ig壳聚糖粉末添加3-5ml环氧氯丙烷和l-5ml ニ胺化合物计；将固体用稀酸(所用稀酸可以是こ酸、盐酸、硫酸等)溶解后，加入三聚磷酸钠和粒径彡lOOnm、纯度不小于95%的四氧化三铁超声波搅拌处理，三聚磷酸钠的加入量为固体重量的O. 05-0. I倍，四氧化三铁的加入量为固体重量的O. 25-0. 75倍，反应完毕后用磁铁吸附体系中的固体颗粒，即为改性后的磁性壳聚糖微粒，记为固体颗粒a ； 2)磁性壳聚糖固定复合蛋白酶将上述改性后的磁性壳聚糖微粒(即固体颗粒a)加入到含2-5V%戊ニ醛的磷酸缓冲液中室温下搅拌1-3 h，然后加入含复合蛋白酶的磷酸缓冲液继续搅拌3-6 h，结束后用磁铁将体系中的固体颗粒吸附出，记为固体颗粒b，备用(固体颗粒b可4°C储存于磷酸缓冲液中，长期储存时，应冷冻干燥保存)；其中，所述磷酸缓冲液浓度为O. 05 - O. 2 mol/L, pH 6. 8-8. O ;投料比按照每Ig改性后的磁性壳聚糖微粒添加10-30mL含戊ニ醛的磷酸缓冲液和2-6 mL含复合蛋白酶的磷酸缓冲液计，复合蛋白酶在体系中的质量终浓度为O. 1-2. 5% ； 3)制备花生蛋白将花生饼柏粉碎、脱油后，采用碱提酸沉提取花生蛋白； 4)制备花生活性肽将花生蛋白用蒸馏水溶解(以每Ig花生蛋白用8一 12ml蒸馏水溶解为宜)并调至pH为8. O — 10. 5，然后加入固体颗粒b于35 — 50で酶解2 — 4h，酶用量为3000 — 4000 u/g蛋白，反应结束后调至酶解反应体系pH为7. O ;酶解过程搅拌转速以 80 — 120 rpm 为宜。5)肽液纯化处理取步骤4)所得酶解反应体系，将除去固体颗粒后的剰余溶液离心，取上清液用活性炭吸附脱色、纳滤膜脱盐、超滤膜分离得花生活性肽精制液，花生肽精制液再经浓缩、喷雾干燥制得花生活性肽干粉。除去固体颗粒的具体操作可以为用磁铁从酶解反应体系中吸附固体颗粒，吸附后将其加入到稀碱液中浸泡10 — 20 min，蒸馏水洗至中性，4°C保存。其中，活性炭吸附脱色条件具体为40 — 60°C搅拌30 — 60 min，活性炭加入量为花生饼柏重量的I 一 4%。纳滤膜截留分子量为70 — 200 Da,超滤膜截留分子量为5000 Da,操作压カO. 15 — O. 25 Mpa。喷雾干燥选用压力喷雾干燥机，3 — 5%肽液浓度，进ロ温度160 — 180°C，出口温度为 7O — 80°C，压カ为 I. 2 — I. 6 Mpa0具体的，步骤I)中，将壳聚糖用碱液浸泡6 — 9 h后，加入环氧氯丙烷于50 — 100°C搅拌(搅拌速度在100 — 300 rpm为宜)反应1_2 h ;所述的ニ胺化合物为こニ胺、I，4_ 丁ニ胺、1，6-已ニ胺、1，8_辛ニ胺或1，12-ニ氨基十二烷等。其中，Ig壳聚糖以用8 一15ml、浓度I mol/L的碱液浸泡为佳，所述碱液可以是NaOH水溶液、KOH水溶液等。步骤I)中，超声波搅拌处理条件为20 kHZ，500 — 800 W，30 — 60 min, 150 - 250rpm ο步骤2)中，复合蛋白酶由碱性蛋白酶和中性蛋白酶按酶活比2:1混合而成，所述碱性蛋白酶为蛋白酶2709或蛋白酶Alcalase，所述中性蛋白酶为胰蛋白酶、蛋白酶Neutrase 或蛋白酶 ASl. 398。步骤3)具体为将花生饼柏粉碎后过60 — 80目，与正己烷混合(以每I克花生 饼柏添加4-8mL正己烷为宜)回流2 — 4 h进行脱油，脱油后的花生饼柏粉与水按质量比1:6 - 12混合，用碱试剂(如NaOH, KOH等)调至pH值为8 — 12，机械搅拌I — 2h (搅拌速度100 — 250 rpm), 4000 — 4500 rpm离心10 — 20 min,取沉淀重复碱提过程,合并两次上清液，用80 — 100目滤网过滤，滤液加酸调至pH为4. 10 — 4. 60，静置10 — 20 min,4000 — 4500 rpm转速下离心10 — 20 min,收集沉淀，即为花生蛋白。本专利技术中所用的粒径彡lOOnm、纯度不小于95%的四氧化三铁可以购买符合条件的市售产品，也可以按照下述方法制备氮气保护下，在Fe3+和Fe2+盐溶液中加入氨水(Fe3+和Fe2+摩尔比为2:1，所加氨水与Fe3+的摩尔比不小于20)，然后于60 — 90°C搅拌反应O. 5 — I. 5 h，反应过程中可通过补加氨水使体系pH始终保持在10以上；反应结束本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种利用固定化酶从花生饼柏中生产活性肽的方法，其特征在于，包括如下步骤 1)制备化学改性的磁性壳聚糖微粒 在碱性条件下，将壳聚糖粉末与环氧氯丙烷混合后于50 - 100°C搅拌反应1-2 h，然后加入二胺化合物继续反应I. 5-2. 5 h，反应结束后固液分离，取固体备用，投料比按照每Ig壳聚糖粉末添加3-5ml环氧氯丙烧和l_5ml 二胺化合物计； 将固体用稀酸溶解后，加入三聚磷酸钠和粒径< lOOnm、纯度不小于95%的四氧化三铁超声波搅拌处理，三聚磷酸钠的加入量为固体重量的0. 05-0. I倍，四氧化三铁的加入量为固体重量的0. 25-0. 75倍，反应完毕后用磁铁吸附体系中的固体颗粒，即为改性后的磁性壳聚糖微粒，记为固体颗粒a ； 2)磁性壳聚糖固定复合蛋白酶将上述改性后的磁性壳聚糖微粒加入到含2-5V%戊二醛的磷酸缓冲液中室温下搅拌1-3 h，然后加入含复合蛋白酶的磷酸缓冲液继续搅拌3-6h，结束后用磁铁将体系中的固体颗粒吸附出，记为固体颗粒b，备用；其中，所述磷酸缓冲液浓度为0. 05 - 0. 2 mol/L,pH 6. 8-8. 0 ;投料比按照每Ig改性后的磁性壳聚糖微粒添加10-30mL含戊二醛的磷酸缓冲液和2-6 mL含复合蛋白酶的磷酸缓冲液计，复合蛋白酶在体系中的质量终浓度为0. 1-2. 5% ； 3)制备花生蛋白将花生饼柏粉碎、脱油后，采用碱提酸沉提取花生蛋白； 4)制备花生活性肽将花生蛋白用蒸馏水溶解并调至pH为8.0— 10. 5，然后加入固体颗粒b于35 — 50 °C酶解2 — 4h，酶用量为3000 — 4000 u/g蛋白，反应结束后调至酶解反应体系PH为7. 0 ; ...

【专利技术属性】
技术研发人员：芦鑫，黄纪念，孙强，侯传伟，宋国辉，张丽霞，
申请(专利权)人：河南省农业科学院，
类型：发明
国别省市：