一种鉴定动物皮张的方法技术

一种鉴定动物皮张的方法，包括以下步骤：采用ＤＮＡ分子标记方法来鉴定。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种鉴定动物物种的方法，特别涉及一种分子标记方法鉴定动物皮的方法，尤其涉及一种分子标记方法鉴定驴皮的方法。
技术介绍
阿胶是中国传统中成药，是由驴皮为原料熬制而成，阿胶含有18种氨基酸和多种益于人体的微量元素，寓除疾健身于一体，具有补血、止血、促进造血，增强免疫力，促进钙的吸收与贮存等广泛的医疗保健功能，尤其是其补血、造血功能优于同类中、西药品。目前在收购驴皮时，需要对驴皮进行鉴定，防止以马皮、骡皮和牛皮等冒充驴皮。驴皮的鉴定常用于驴皮作为中药材鉴定，一般采用质谱或色谱分析、同工酶等基于蛋白质成分的分析方法，但是由于动物个体之间蛋白质构成上的差异，这些方法存在一定的误差，难以标准化。最先进的方法是用分子物种鉴定方法，用分子标记方法来进行鉴定，可以迅速、准确、高效地同时检测鉴定大量样品。分子物种鉴定已经应用于食品科学中的肉类鉴定，通常用微卫星方法鉴别马肉、牛肉、羊肉和猪肉等，但是驴肉的鉴定尚没有报道，这一是因为驴肉不常用于食品加工，鉴定的意义不大。专利技术人查阅了国内外大量文献，提出用细胞色素B基因PCR-RFLP方法来对驴皮进行鉴定，目前该鉴定方法还属空白。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种鉴定动物物种的方法，特别提供一种分子标记方法鉴定动物皮的方法，尤其提供一种分子标记方法鉴定驴皮的方法，填补了分子标记方法鉴定驴皮的空白。本专利技术选择了线粒体细胞色素B基因PCR-RFLP指纹图谱作为鉴定依据，其理由一是由于陈旧干皮中的基因组DNA已经严重降解，针对基因组DNA的分子标记方法如RAPD，微卫星等难以应用。二是因为线粒体细胞色素B基因具有极高的保守性，在物种之内几乎不存在变异，而在物种之间存在单核苷酸的差异，可以用PCR-RFLP方法方便地检测出来，是一种可用于物种鉴定的标记基因。由于细胞色素B基因在不同物种之间具有一段高度保守的区域，可以用一对引物扩增所有物种的细胞色素B基因保守片段用于检测，免除了对每一物种使用不同引物进行扩增的麻烦。而且由于线粒体基因在细胞中具有较多的拷贝数，即使基因组DNA已经完全降解，线粒体DNA也可能还存在，可以比较容易地用PCR方法扩增出来。本专利技术的目的是通过以下技术方案来完成的一种鉴定动物物种，尤其是鉴定动物皮的方法，包括以下步骤采用DNA分子标记方法来鉴定；所述DNA分子标记方法为细胞色素B基因(cytB)聚合酶链式反应-限制性酶切片段长度多态性(PCR-RFLP)方法来鉴定；所述方法包括制得图3或图4所示指纹图谱来鉴定；所述制备方法还包括提取动物皮样DNA，并以此为PCR扩增模板；根据动物皮样DNA，设计并合成引物B15’-CCATCCAACATCTCAGCATGATGAAA-3’，B25’-GCCCCTCAGAATGATATTTGTCCTCA-3’；用已知PCR方法扩增获得细胞色素B基因PCR产物，所述PCR产物为细胞色素B基因359bpDNA片断，其序列为图5所示核苷酸序列；所述DNA是指PCR至少扩增一次的细胞色素B(cyt B)基因的DNA；所述DNA是指PCR扩增二次细胞色素B基因的DNA；所述DNA是指PCR扩增三次细胞色素B(cyt B)基因片断的DNA；用限制性内切酶切割细胞色素B基因PCR产物；所述限制性切酶的内切酶可为Hinf I、Hae III、Alu I、MboI、Taq I和Mse I之一或其组合；电泳PCR产物获得所述DNA指纹图谱；所述PCR扩增产物DNA含量可为10-500ng/ul。所述动物皮，如驴皮、马皮、牛皮、骡皮DNA的提取方法，可按已知的临床样品DNA提取试剂盒说明书提取个样品总DNA；也可用本专利技术改进的干皮DNA提取方法提取，该提取得到的DNA可作为本专利技术PCR扩增用的模板，提取所述DNA的方法，包括以下步骤 剪取皮张样品，除去皮张外表面的毛发及其它附着物，并除去内表面的的污染层，将皮张剪切细小的微粒；称取切好的皮样置于Eppendorf管中，以去离子水双蒸水振荡或吹打洗涤2～3次，吸去水和杂质；在所述Eppendorf管中加入消化液，蛋白酶K和SDS过夜，所述消化液为10mmol/L Tris HCl，PH可为8.0，1mmol/LCaCl2，4M尿素，0.5％SDS，0.2mg/ml蛋白酶K；离心，取上清液放入另一离心管中；加入等体积的酚∶氯仿∶异戊醇，体积比可为25∶24∶1，抽提样品，所述抽提时最好快速、低温，最好在5分钟以内；可冰上操作；离心，吸取上清液；加入等体积的氯仿∶异戊醇，体积比可为24∶1，抽提样品，所述抽提时最好快速、低温，最好在5分钟以内；可冰上操作；离心，吸取上清液；加入3mol/L的NaAc溶液，混匀后加适量无水乙醇，混匀置于-5℃～-20℃30分钟以上。离心，弃去上清液；加入70％乙醇，离心，弃去上清；干燥，将干燥的沉淀物溶于适量纯水中；0-10℃暂时保存备用或者-20℃长期保存，得提取物。所述动物皮DNA的提取方法，还包括用常规生物方法方法检测提取的DNA的质量，尤其用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测提取的DNA的质量，用λDNA/Hind III Marker(标记)作为分子量标准，点样电泳检测；用已知的紫外灯下观察或用凝胶成像系统拍照；也可用DNA微量定量仪检测DNA浓度，所述动物皮DNA电泳图谱为图1所示；以所提取的DNA为模板，进行PCR设计和合成引物、扩增获得细胞色素B基因片段，即获得所述DNA的片断，其方法可为从GenBank中查询驴、牛、马、骡等动物的线粒体基因组DNA序列，截取其中的细胞色素B基因序列；并根据截取的细胞色素B基因序列，用已知方法设计合成一对PCR引物； 为保证一对引物可以扩增出所有动物的细胞色素B基因片段，还可采用以下方法PCR引物根据保守序列设计，首先用已知软件，如Clustal W软件，将将要鉴定的动物细胞色素B基因序列进行多序列比较和对准(align)，找到保守区间，采用PCR引物设计软件，如Oligo 6.0 PCR引物设计软件，在此区间内设计引物，按已知方法合成引物，该引物序列如下B15’-CCATCCAACATCTCAGCATGATGAAA-3’B25’-GCCCCTCAGAATGATATTTGTCCTCA-3’所述细胞色素B基因片段(Cyt B)PCR扩增方法，包括以下步骤可经过多次PCR扩增条件优化，确定合适的PCR扩增条件为每个PCR反应体积含模板DNA，10mM Tris-HCl(pH8.3)，50mM KCl，0.2mM 4种dNTPs，2.0mM MgCl2和2.0单位Taq DNA聚合酶；在按常规PCR扩增反应条件扩增细胞色素B基因片段；所述PCR扩增后产生图5所述359bp的DNA片段，即细胞色素B基因；为了提高特异性，避免产生非特异性扩增，可采用已知的热启动方式，或直接采用热启动型的Taq DNA聚合酶；由于各个皮张样品陈旧程度不一样，提取的DNA浓度差异很大，第一次扩增可能条带有强有弱，有的可能有非特异扩增或背景较高；可进行PCR定量，即根据第一次PCR扩增的结果，确定DNA样品中目标模板DNA的数量，再据此调整第二次PCR扩增的模板量，还可多次调整，进行更多次PCR扩增，获得强度比较一致的扩增条带，可保证在进本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：章安，尤金花，解福生，师秀梅，
申请(专利权)人：山东阿华生物药业有限公司，
类型：发明
国别省市：