一种苯酚人工抗原合成方法技术

本发明专利技术涉及一种苯酚人工抗原的制备方法，以阿魏酸半抗原作为苯酚结构相似物，采用混合酸酐法将阿魏酸与载体蛋白（牛血清蛋白BSA）偶联，制备一种苯酚人工抗原；所述方法合成步骤简单，反应条件容易实现，操作方便，后处理分离方法简便，产物偶联比在n=20~35之间，该范围偶联比值的BSA人工抗原具有良好的免疫活性，适合用作免疫抗原制备抗体，制得的抗体效价良好，对苯酚具有良好的识别检测性能，该抗体检测苯酚的灵敏度达到0.15ppm。

【技术实现步骤摘要】
一种苯酚人工抗原合成方法
本专利技术涉及一种人工抗原合成方法，具体为高免疫活性的苯酚人工抗原合成方法。
技术介绍
苯酚(化学式：C6H5OH，PhOH)，又名石炭酸、羟基苯，是一种重要的有机化工原料，环境中的苯酚主要来源于炼焦，炼油，石油化工，化肥，农药，塑料制造，燃烧等过程，卷烟燃烧过程中也会产生该化合物，属于卷烟烟气七种有害成份之一。苯酚主要由呼吸道和皮肤进入人体而引起中毒，属高毒类物质，对细胞有直接损害，能使粘膜，心血管和中枢神经系统受到腐蚀，损害和抑制，对生物体的危害很大，给环境会造成严重的污染。因此亟需建立一种简单，快速，特异性强的苯酚测定及降害方法。目前苯酚的分析方法包括光度法，色谱法和电化学法等，这些方法分析测定苯酚时需对样品进行复杂的前处理，耗时较长，且仪器昂贵，操作复杂，无法实现现场分析；同时，烟草行业一直在积极探索各类方法降低卷烟烟气中苯酚的含量，现有的方法主要包括在滤嘴中添加活性炭或其它介孔材料吸附去除有害物质，然而这些材料很难特异性吸附有害物质，往往也将烟气中的香味成分一同吸附，造成卷烟香味损失。为了能及时、快速、简便的分析并降低环境、卷烟产品中苯酚的含量，需要发展一种苯酚的专一性检测及降害技术。因此建立成本低、快速、结果准确、方法通用性强的酶联免疫技术方法非常必要。为了得到特异性强，灵敏度高、价格低廉的高效抗体，这就需要合成能产生特异性抗体的免疫抗原。但由于苯酚分子量较小，结构简单，与载体蛋白直接相连不易诱导产生效价高、特异性好的抗体，且苯酚分子不含有直接能与蛋白偶联的活性基团，因此选择结构类似的替代物阿魏酸原料作为苯酚结构相似物，以三正丁胺为催化剂，与氯甲酸异丁酯反应生成混合酸酐，然后与生物高分子载体蛋白BSA等进行的偶联，经透析纯化，冷冻干燥。通过高分辨率质谱技术计算出半抗原小分子在载体蛋白上的偶联数，获得具有较高免疫原性的苯酚人工抗原。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种苯酚人工抗原的制备方法，所制备的高活性抗原可用于免疫产生针对苯酚的抗体，为建立酶联免疫检测方法检测苯酚奠定基础。本专利技术是通过以下技术方案实现的：本专利技术第一方面公开了一种苯酚人工抗原的制备方法，以阿魏酸为苯酚结构相似物，在叔胺催化下，阿魏酸和氯甲酸异丁酯反应，生成阿魏酸甲酸异丁酯混合酸酐作为半抗原，然后采将生成的阿魏酸甲酸异丁酯混合酸酐与载体蛋白偶联，制备苯酚人工抗原。制得的苯酚人工抗原利用基质辅助激光解析飞行时间质谱仪测定其分子量，将人工抗原与载体蛋白分子质量进行比较，根据所得差值和半抗原分子量计算偶联比，从而为免疫产生针对苯酚的特异性抗体、建立酶联免疫快速检测方法奠定基础。一种苯酚人工抗原的制备方法，具体包括以下步骤：(1)将阿魏酸溶解于溶剂中，加入催化剂，以及反应试剂氯甲酸异丁酯，反应；(2)反应完全后静置，然后离心分离，获得阿魏酸甲酸异丁酯混合酸酐上清液；(3)取载体蛋白溶解于缓冲溶液中，然后缓慢滴加步骤(2)分离得到的酯混合酸酐上清液，进行偶联反应，制得苯酚人工抗原。其中，优选的，步骤(1)中，所述溶解采用的方式为超声溶解，超声频率30～45kHz，功率200～300W，更优选为超声频率40kHz，功率200W。优选的，步骤(1)中，所述溶剂选自二氧六环和N，N-二甲基甲酰胺。优选的，步骤(1)中，所述催化剂选自三正丁胺和三乙胺，更优选三正丁胺。优选的，步骤(1)中，所述阿魏酸、溶剂、催化剂和反应试剂的质量比例为0.5～1：20～40：0.5～1：0.5～2。优选的，步骤(1)中，所述反应的方式为室温搅拌反应，反应的时间为1-3小时。优选的，步骤(2)中，所述静置的温度为4～25℃，更优选为20℃；静置的时间为1～3小时，更优选为1小时。优选的，步骤(2)中，所述离心分离的转速为4000～10000rpm，更优选为8000rpm；离心的时间为10～20min，更优选为10min。优选的，步骤(3)中，所述载体蛋白选自牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA)、卵清白蛋白(OVA)和钥孔血蓝蛋白(KLH)，更优选用容易产生抗原效应的牛血清白蛋白(BSA)。优选的，步骤(3)中，采用超声溶解的方式将载体蛋白溶解于缓冲液中。优选的，步骤(3)中，载体蛋白、缓冲溶液与混合酸酐上清液的质量之比为0.1～0.2：10～15：2～4。优选的，步骤(3)中，所述缓冲溶液为PBS缓冲液，所述PBS缓冲液的pH＝7.2-7.4，包括以下浓度的组分：NaCl为137mmol/L，KCl为2.7mmol/L，Na2HPO4为10mmol/L，KH2PO4为2mmol/L，其余为水。优选的，步骤(3)中，所述滴加的速度为2～4滴/s。优选的，步骤(3)中，所述偶联反应的条件为冰水浴条件；所述偶联反应的时间为6～10小时，更优选为8小时。进一步的，步骤(3)反应结束后，还包括苯酚人工抗原的分离过程：(a)取透析袋并进行前处理，去除二氧六环以及其他杂质；(b)将步骤(3)偶联反应制得的苯酚人工抗原混合液移入处理后的透析袋中，然后将透析袋置于PBS缓冲液中进行第一次搅拌透析处理，之后再置于去离子水中进行第二次搅拌透析处理；(c)透析结束后，将透析袋中的人工抗原溶液冷冻处理，然后冷冻干燥，制得苯酚人工抗原白色粉末。优选的，步骤(a)中，所述透析袋的前处理过程为：取宽度为10～15cm规格的透析袋，置于含2wt％的碳酸氢钠和1mmol/L的EDTA混合水溶液中煮沸10min，取出透析袋用蒸馏水冲洗干净；取1mmol/LEDTA水溶液并用稀NaOH溶液调pH为8左右，然后将透析袋置于其中再次煮沸10min，最后用去离子水浸泡洗净后放在4℃冰箱中备用。优选的，步骤(b)中，所述第一次搅拌透析处理的温度为0-5℃，透析的时间为12～24小时；第二次搅拌透析的温度为0-5℃，透析的时间为10～12小时。更优选的，步骤(b)中，所述第一次搅拌透析处理的温度为4℃，第二次搅拌透析的温度为4℃。优选的，步骤(c)中，所述冷冻处理的温度为-45℃，冷冻处理的时间为12-24小时，更优选为24小时。优选的，步骤(c)中，所述冷冻干燥的时间为12-24小时，更优选为24小时。以牛血清白蛋白(BSA)为载体蛋白，步骤(3)所述偶联反应过程可表示如下：其中，n为偶联比。对于制得的苯酚人工抗原表征：偶联比测定是计算人工合成抗原中被偶联的两种分子的比率(偶联比率)的方法，测定方法的种类很多，主要依据检测偶联物中被偶联的两种分子含量(或相对含量)的原理建立起来的。对载体蛋白(如，BSA)以及苯酚人工抗原用基质辅助激光解析飞行时间质谱仪(MALDI-TOF-MS)进行表征，采用线性正离子模式检测，加速电压25kv，进样量为1μL。设半抗原与人工抗原的偶联比为n:1，将所测人工抗原的分子量与载体蛋白分子量代入下式计算：对于偶联物蛋白浓度的测定：采用考马斯亮蓝法测定蛋白浓度，配制浓度分别为250、450、600、800、1000μg/mL的牛血清白蛋白溶液0.1mL，加入5mL考马斯亮蓝染液，立即混匀，静置5min，在595nm处测定吸光值，绘制蛋白浓度与吸光值的工作曲线。将人工抗原溶液按一定比例稀释后在相同条件下测定吸光度值，带入曲线方程计算得到人工本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种苯酚人工抗原的制备方法，以阿魏酸作为苯酚结构相似物，用混合酸酐法将阿魏酸与载体蛋白进行偶联反应，制备苯酚人工抗原。

【技术特征摘要】
1.一种苯酚人工抗原的制备方法，以阿魏酸作为苯酚结构相似物，用混合酸酐法将阿魏酸与载体蛋白进行偶联反应，制备苯酚人工抗原；所述方法具体包括以下步骤：(1)将阿魏酸溶解于溶剂中，加入催化剂三正丁胺，以及反应试剂氯甲酸异丁酯，反应；(2)反应完全后静置，然后离心分离，获得阿魏酸甲酸异丁酯混合酸酐上清液；(3)取载体蛋白溶解于缓冲溶液中，然后缓慢滴加步骤(2)分离得到的酯混合酸酐上清液，进行偶联反应，制得苯酚人工抗原。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述溶解采用的方式为超声溶解，超声频率30～45kHz，功率200～300W。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述溶剂选自二氧六环和N，N-二甲基甲酰胺。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述阿魏酸、溶剂、催化剂和反应试剂的质量比例为0.5～1：20～40：0.5～1：0.5～2。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述反应的方式为室温搅拌反应，反应的时间为1-3小时。6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述静置的温度为4～25℃；静置的时间为1～3小时。7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述离心分离的转速为4000～10000rpm；离心的时间为10min。8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述载体蛋白选自牛血清白蛋白BSA、人血清白蛋白HSA、卵清白蛋白OVA和钥孔血蓝蛋白KLH中的任意一种。9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，采用超声溶解的方式将载体蛋白溶解于缓冲液中。10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，载体蛋白、缓冲溶液与混合酸酐上清液的质量之比为0.1～0.2：10～15：2～4。11.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述缓冲溶液为PBS缓冲液，所述PBS缓冲液的pH＝7.2-7.4，包括以下浓度的组...

【专利技术属性】
技术研发人员：沙云菲，戚大伟，王颖，刘百战，
申请(专利权)人：上海烟草集团有限责任公司，
类型：发明
国别省市：上海;31