克拉霉素衍生物及其制备方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种克拉霉素衍生物及其制备方法与应用，旨在提供既能最大程度保留了克拉霉素的特征结构，又具有可以与载体蛋白发生偶联的活性基团的克拉霉素衍生物，并且以该克拉霉素衍生物制备人工抗原和抗体，用来检测检测大环内酯类化合物中，其技术方案，所述克拉霉素衍生物，所述结构如下式所示：所述克拉霉素人工抗原为所述克拉霉素衍生物与载体蛋白偶联制得的；属于生物技术领域；

Clarithromycin derivative, preparation method and application thereof

The invention discloses a clarithromycin derivatives and preparation method and application thereof, which aims to provide not only to maximize the retention of the characteristic structure of clarithromycin, clarithromycin and derivatives with active groups can be conjugated to a carrier protein, and the clarithromycin derivatives preparation of artificial antigen and antibody for detection of macrolide compounds in the technical scheme, the clarithromycin derivatives, the structure is shown as the following formula: the artificial antigen of clarithromycin for the clarithromycin derivatives coupled with carrier protein prepared; belongs to the field of biotechnology;

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，具体涉及一种克拉霉素衍生物，以及克拉霉素衍生物作为半抗原在制备克拉霉素包被原、免疫原中的应用。
技术介绍
克拉霉素属于大环内酯类抗生素，对大多数革兰阳性菌、部分革兰阴性菌及一些非典型致病菌(支原体、衣原体等)均有效。是红霉素的第二代衍生物之一。红霉素的第二代衍生物主要成员有罗红霉素、阿奇霉素、克拉霉素、地红霉素等。由于其第二代衍生物避免了被胃酸破坏，提高了吸收率，抗菌活性更强，因而广泛用于治疗呼吸道感染的一线药物。但近来有报道，红霉素第二代衍生物长期、持续的给药，对肝脏有毒害；对前庭系统有影响，能引起耳鸣、听觉障碍等；还能引起药热、药疹、荨麻疹等过敏反应以及部分药物可引起腹痛、腹泻、恶心等胃肠道反应；其中，克拉霉素、阿奇霉素等可能发生幻觉、失眠、意识模糊等中枢神经系统副作用，以及易透过胎盘屏障。因此，国际上有关大环内酯类抗生素的最高残留限量有着非常严格的规定，我国也出台了相应的法规来规范大环内酯类抗生素的使用。我国出台的蜂蜜产品中大环内酯类药物残留定量限为1.0μg/kg以下。为了打击非法用药，保护消费者的健康与安全，迫切需要健全相关的检测方法。目前，兽药残留检测常用的方法有气相色谱、高效液相色谱以及气质联用等理化分析方法。虽然这些方法特异性强、灵敏度高，但是样品前处理操作步骤繁琐，成本较高，也不适用于大批量样品的筛选检测。免疫化学分析鉴于在抗原抗体的定性定量方面独特的优势和操作简便快捷、成本低、灵敏度较高、分析样本量大的优点弥补了理化分析的不足。因此，建立免疫化学分析法检测克拉霉素的残留具有重要的经济意义和社会意义。专利技术内容针对上述问题，本专利技术的第一个目的是提供一种既能最大程度保留了克拉霉素的特征结构，又具有可以与载体蛋白发生偶联的活性基团的克拉霉素衍生物及其制备方法。本专利技术的第二个目的是提供含克拉霉素衍生物的的在制备克拉霉素免疫和克拉霉素包被原中的应用。本专利技术的第三个目的是提供上述克拉霉素免疫和克拉霉素包被原的制备方法。为此，本专利技术的第一个技术方案是这样的：一种克拉霉素衍生物，所述结构如式I所示：上述克拉霉素衍生物的方法，依次包括如下步骤：3)将克拉霉加入反应瓶中，每1mmol加入10ml稀盐酸，在室温下磁力搅拌1.5-2.5小时，补加水，并调调节溶液pH为8.0-9.0，析出白色固体，加固体氯化钠使溶液饱和，缓慢搅拌25-35分钟，抽滤，取滤饼溶于乙酸乙酯中，用饱和氯化钠水溶液洗涤，取乙酸乙酯层，用无水硫酸钠干燥2小时，过滤，减压旋蒸乙酸乙酯，得到白色固体，为中间体；4)取步骤1)制备的中间体加入反应瓶中,再加溶剂和γ-氨基丁酸，在60℃，磁力搅拌10-14小时，冷却后减压旋蒸溶剂，再加入水使之析出淡黄色固体，过滤，滤饼用混合溶剂淋洗，鼓风烘干，得到克拉霉素衍生物；其中：所述的中间体和所述γ-氨基丁酸摩尔比1:1.2～1.8。进一步的，上述的克拉霉素衍生物的制备方法，所述的混合溶剂为体积比1:1的异丙醇和水。本专利技术提供的第二个技术方案是上述的克拉霉素衍生物在制备克拉霉素包被原中的应用。一种克拉霉素包被原，所述的克拉霉素包被原由克拉霉素衍生物与牛血清白蛋白偶联制得的，结构式如式(Ⅱ)所示：本专利技术提供的第三个技术方案是上述的克拉霉素衍生物在制备的克拉霉素免疫原中的应用。一种克拉霉素免疫原，所述的克拉霉素免疫原由克拉霉素衍生物与鲎血蓝蛋白偶联制得的，结构式所述结构如式Ⅲ所示：本专利技术提供的第四个技术方案是这样的：1)动物免疫用上述的克拉霉素免疫原免疫新西兰大白兔；2)兔血清的收集与保存取冲击免疫后第七天的耳缘静脉采血检测血清效价及抑制，免疫八次后，心脏采全血，离心收集血清即为多克隆抗体。本专利技术提供的最后一个技术方案是上述克拉霉素多克隆抗体在检测克拉霉素中的应用或者在检测大环内酯类化合物中的应用。与现有技术相比，本专利技术提供的技术方案具有如下优点：1、本专利技术提供的克拉霉衍生物既能最大程度保留了克拉霉素的特征结构，又具有可以与载体蛋白发生偶联的活性基团；2、本专利技术提供的克拉霉衍生物所制备人工抗原和抗体定性定量准备，操作简便快捷、成本低、灵敏度较高、分析样本量大的优点。3、本专利技术提供的克拉霉素人工抗原可以检测克拉霉素药物残留，也可以检测红霉素药物残留，用途广泛。附图说明图1是克拉霉素包被原紫外光谱扫描结果；图2是克拉霉素免疫原紫外光谱扫描结果；图3是多克隆抗体在不同浓度标准品溶液的吸光值。具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本专利技术，但并不限定本专利技术。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量实验，均设置三次重复实验，结果取平均值。克拉霉素购自湖北威得利化学科技有限公司。实施例中所用的PBS缓冲液均为pH为7.4、0.01M的PBS缓冲液。鲎血蓝蛋白,简称LPH。牛血清白蛋白,简称BSA。实施例11)将克拉霉素750.6mg(1mmol)加入50ml反应瓶中，加入10ml稀盐酸，室温，磁力搅拌2小时，补加20ml水，用浓氨水调pH为8.0-9.0，析出白色固体，加固体氯化钠使溶液饱和，缓慢搅拌30分钟，抽滤，取滤饼溶于50ml乙酸乙酯中，用饱和氯化钠水溶液洗涤3次，取乙酸乙酯层，用无水硫酸钠干燥2小时，过滤，减压旋蒸乙酸乙酯，得到白色固体，为克拉霉素衍生物中间体432.7mg。2)将步骤1)制备的中间体300.6mg(0.51mmol)加入10ml反应瓶中,加入5ml甲醇,加入γ-氨基丁酸78.8mg(1.5N)，60℃，磁力搅拌12小时，冷却，减压旋蒸溶剂，加入10ml水，析出淡黄色固体。过滤，滤饼用10ml混合溶剂(V异丙醇：V水＝1:1)淋洗，鼓风烘干，得到克拉霉素衍生物(式I)，216.8mg。实施例2、制备克拉霉素人工抗原一、克拉霉素包被原的合成(1)将27.7mg实施例1制备的式(I)所示化合物溶于2mlN,N-二甲基甲酰胺中，加入10mgN-羟基琥珀酰亚胺和10mg1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，室温下磁力搅拌2h，得到溶液a。(2)将66mg牛血清白蛋白加入8ml去离子水中，室温下磁力搅拌，充分溶解，即为溶液b。(3)将溶液a滴加至溶液b中，室温缓慢搅拌8h,后入透析袋，在PBS中，4℃透析72h(中间换水5次)，然后于4℃条件下，4000rmp离心10min，取上清，即克拉霉素包被原溶液，分装于安培瓶中，-20℃保存，克拉霉素包被原简称CL-BSA(结构式如式(Ⅱ)所示，克拉霉素包被原溶液简称CL-BSA溶液。(4)将CL-BSA溶液用PBS缓冲溶液稀释后，测定280nm和260nm的分光光度值，按公式计算稀释溶液中的蛋白浓度，将测得的蛋白浓度值乘以其稀释倍数后即为原CL-BSA溶液中的CL-BSA浓度。蛋白质浓度(mg/ml)＝1.45*OD280-0.74*OD260。CL-BSA溶液中的CL-BSA浓度为8.6mg/ml。二、克拉霉素包被原的表征将CL-BSA溶液用PBS缓冲溶液稀释(使CL-BSA的浓度为5mg/ml)，作为溶液甲；将含5mg/ml克拉霉素的PBS缓冲溶液作为乙；将含5mg/mlBSA的PBS缓冲溶本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种克拉霉素衍生物，其特征在于，所述结构如式I所示：

【技术特征摘要】
1.一种克拉霉素衍生物，其特征在于，所述结构如式I所示：2.制备权利要求1所述克拉霉素衍生物的方法，其特征在于，依次包括下述步骤包括如下步骤：1)将克拉霉加入反应瓶中，并且每1mmol加入10ml稀盐酸，在室温下磁力搅拌1.5-2.5小时，加水稀释，并调节溶液pH为8.0-9.0，析出白色固体，加固体氯化钠使溶液饱和，缓慢搅拌25-35分钟，抽滤，取滤饼溶于乙酸乙酯中，用饱和氯化钠水溶液洗涤，取乙酸乙酯层，用无水硫酸钠干燥2小时，过滤，减压旋蒸乙酸乙酯，得到白色固体，为中间体；2)取步骤1)制备的中间体加入反应瓶中,再加溶剂和γ-氨基丁酸，在60℃，磁力搅拌10-14小时，冷却后减压旋蒸溶剂，再加入水使之析出淡黄色固体，过滤，滤饼用混合溶剂淋洗，鼓风烘干，得到克拉霉素衍生物；其中：所述的中间体和所述γ-氨基丁酸摩尔比1:1.2～1.8。3.根据权利要求1所述的克拉霉素衍生物的制备方法，其特征在于，所述的混合溶...

【专利技术属性】
技术研发人员：宁波，李隆军，刘明如，赖启隆，朱永利，何秀平，黄斌，
申请(专利权)人：深圳市绿诗源生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44