本发明专利技术属于微生物领域，具体涉及一种来源于纤维堆囊菌(Sorangiumcellulosum)菌株基因组内的基因epoO及其在埃博霉素合成中的应用。来源于纤维堆囊菌的调控基因epoO，其特征在于，它具有SEQ?ID?NO.1所示的核苷酸序列。本发明专利技术的埃博霉素调控基因epoO为首次报道，该基因与纤维堆囊菌发酵合成埃博霉素密切相关。通过分子生物学手段对该基因内部结构的改造或直接替换成其他启动子，可以显著提高菌株埃博霉素发酵产量。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于微生物领域，具体涉及一种来源于纤维堆囊菌{Sorangiumcellulosum)菌株基因组内的基因及其在埃博霉素合成中的应用。
技术介绍
埃博霉素{Epothilone)是由粘细菌纤维堆囊菌产生的一类16元大环内酯类化合物，具有促微管聚合活性，其作用机制类似于紫杉醇(Jaxom (附图1)，目前已经发现了多种epo thi1ne结构类似物，相关专利技术专利已经超过800篇,epo thi1nes已经成为目前生物医药方面令人兴奋的研究热点之一。它被认为是紫杉醇类抗肿瘤化合物的更新换代产品。与紫杉醇相比具有明显的优势:①分子结构简单，水溶性更好-S^Epothilone的噻唑环结构与微管作用更加紧密.ΜEpothilone不会产生长期使用紫杉醇类药物带来的白细胞减少，脱发等症状.' Epothilone具有比紫杉醇更广泛的抗肿瘤谱，一般比紫杉醇的抗肿瘤活性高5到25倍-MEpothilone具有对多重耐药性及耐紫杉醇肿瘤细胞的很高的细胞毒活性，比紫杉醇强2000-5000倍.MEpothilone由微生物产生，可以通过发酵进行大规模制备，不必像紫杉醇那样必须通过对杉树的采伐或者复杂的化学合成途径来获取。目前已经有多种印othilone类化合物进入不同阶段的临床评估，如BMS-247550，BMS-310705，EP0-906, K0S-862 以及 ΖΚ-ΕΡ0 等。其中 BMS-247550 是 epothilone B 的大环内酰胺结构类似物，已经于200·7年10月在美国上市销售，起到了让人满意的效果。鉴于化学合成法的高成本及低收率，目前国际上埃博霉素的生产均采用微生物发酵法，但由于其生产菌株纤维堆囊菌的遗传特性，目前很难对其进行异源表达提高产量，因此除发酵条件优化及传统的菌种改良外，对生产菌株本身的遗传改造也具有重要的应用价值。目前国际上已经报道了负责合成的基因簇，为杂合型的I型聚酮合酶基因簇(NRPS/PKS)(附图2)，但其相关调控基因目前还几乎没有相关报道，如能发现重要的epothilone合成调控基因并对其进行有效改造,贝U可以显著提高epothilone产量。
技术实现思路
本专利技术从纤维堆囊菌{Sorangium ceBWios ) SoO 157-2中发现一个与埃博霉素合成相关的调控基因印00，该基因的序列为:5’-CATTTTTTTGAGACTCTGCT CAAAGGGATTAGATCGAGTGAGACAGTTCT-3’，该基因长度为50bp，包含启动子应有的-10区和-35区特征。本专利技术还公开改造该基因的方法，应用该方法可以提高埃博霉素发酵产量。来自于纤维堆囊菌的调控基因6./7θ0，它具有SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列。该基因位于埃博霉素合成酶基因簇第一个翻译起始密码子上游l_230bp范围内。本专利技术还要保护的是，该基因在埃博霉素合成中的应用以及该基因在抑制肿瘤细胞生长及诱导细胞程序性死亡中的活性。上述来自于纤维堆囊菌的调控基因印00，可以采用引物、载体和异源宿主改造。上述的引物为157印o5111-6114F、157印05111-6114D、157-印O6137-7680F、157-印O6137-7680D 中的任一种。上述载体包括PCC11、PCVD442、PRK2013中的任一种。上述异源宿主包括大肠杆菌DH5 a、Top 10、BL21(DE3)中的任一种。本专利技术的埃博霉素调控基因印oQ为首次报道，该基因与纤维堆囊菌发酵合成埃博霉素密切相关。通过分子生物学手段对该基因内部结构的改造或直接替换成其他启动子，可以显著提高菌株埃博霉素发酵产量。附图说明图1 埃博霉素A {epothileon A)及紫杉醇(Taxol)分子结构图，埃博霉素A{epothileon A)及紫杉醇(JaxoT)分子结构图(A为埃博霉素A ;B为紫杉醇)； 图2合成酶基因簇结构合成酶基因簇结构；图3实施例3中调控基因印oQ的PCR扩增结果电泳谱图，调控基因epoO的PCR扩增结果电泳谱图(I, 2为扩增的DNA片段；3为DNA marker DL2000)； 图4实施例1以pCCl I质粒为载体构建的重组载体，实施例1以pCCll质粒为载体构建的重组载体； 图5实施例2接合子照片； 图6实施例1中阳性结合子发酵后埃博霉素的HPLC检测谱图，实施例1中阳性结合子发酵后埃博霉素的HPLC检测谱图。具体实施方式 下面结合附图和具体实施方式来对本专利技术作更进一步的说明，以便本领域的技术人员更了解本专利技术，但并不以此限制本专利技术。纤维堆囊菌埃博霉素合成调控基因印OQ序列为: 5 ‘-CATTTTTTTGAGACTCTGCTCAAAGGGATTAGATCGAGTGAGACAGTTCT-3’ ，该序列位于epothilone合成酶基因簇上游。实施例中所用原料均可市场购得，实施例中所用高效液相色谱仪为LC-2010A HT,Shimadzu0实施例1 敲除部分片段(前端颈环结构)举例: 以纤维堆囊菌So0157-2基因组为模板，采用引物EOFl和EORl:EOFl: 5’ -CCCCTCGAGCCACAGCATCAGG-3’ ; EORl: 5 ’ -CGAGGTCGGGATCCAACCACGC-3 ’，按照表I配制PCR扩增体系，并采用表I所示进行PCR扩增，即可得到含有调控基因印oQ的DNA片段，如附图3所示。表I PCR扩增体系各组分含量__添加物I体积—ddHa010.4 μ L2XGCbufferI12.5μ LSo0157-2genomeDNA(10ng/μ L)0.5 μ LPrimerupEOFl (62.5 μ Μ)0.2 μ L权利要求1.来自于纤维堆囊菌的基因6./7θ0，其特征在于，它具有SEQID N0.1所示的核苷酸序列。2.如权利要求1所述来自于纤维堆囊菌的基因印00，其特征在于，该基因位于埃博霉素合成酶基因簇第一个翻译起始密码子上游l_230bp范围内。3.如权利要求1所述来自于纤维堆囊菌的基因印00，其特征在于，该基因在埃博霉素合成中的应用。4.如权利要求1所述来自于纤维堆囊菌的基因印00，其特征在于，该基因在抑制肿瘤细胞生长及诱导细胞程序性死亡中的活性。5.如权利要求1所述来自于纤维堆囊菌的基因epoO，采用引物、载体和异源宿主改造。6.如权利要求5中所述来自于纤维堆囊菌的基因epoO，其特征在于，所述的引物为157epo5111-6114FU57epo5111-6114DU57-epo6137-7680FU57-epo6137-7680D 中的任一种。7.如权利要求5中所述来自于纤维堆囊菌的基因epoO，其特征在于，所述载体包括PCC11、PCVD442、PRK2013 中的任一种。8.权利要求5中所述来自于纤维堆囊菌的基因epoO，其特征在于，所述异源宿主包括大肠杆菌DH5a 、Top 10、BL21(DE3)中的任一种。全文摘要本专利技术属于微生物领域，具体涉及一种来源于纤维堆囊菌(Sorangiumcellulosum)菌株基因组内的基因epoO及其在埃博霉素合成中的应用。来源于纤维堆囊菌的调控基因epoO，其特征在于，它具有SEQ I本文档来自技高网...
【技术保护点】
来自于纤维堆囊菌的基因epoO，其特征在于，它具有SEQ?ID?NO.1所示的核苷酸序列。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：赵林，刘新利，孙欣，李越中，黎志凤，
申请(专利权)人：山东轻工业学院，
类型：发明
国别省市：
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