本发明专利技术公开了大豆小RNA基因gma-miR169d，它是利用Solexa测序技术获得了的microRNAs，分析结果表明，豆小RNA基因gma-miR169d与大豆干旱调控相关，将含有gma-miR169d的成熟基因片段连接到载体上，并转入拟南芥，通过抑制拟南芥细胞内的靶基因的表达来进一步提高拟南芥对干旱的耐受能力。解决了转耐干旱基因操作涉及基因序列过长而遭遇转化困难等问题，该类干旱诱导的miRcroNA为小分子表达调控基因，且为大豆内源性microRNA，不编码产生蛋白。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属植物基因工程
，具体涉及一个大豆抗干旱大豆HiiCT0RNA基因gma-miR169d,及其在抗旱调控中的应用。
技术介绍
植物在生长过程中受到生物和非生物类的逆境胁迫，其中干旱是植物正常生长重要限制性因素之一。干旱会引起植物原生质体脱水，改变细胞膜的结构与透性，最终导致农作物产量降低。植物在干旱的过程中，通过关键基因的调控抵御或防卫干旱带来的不利影响。利用抗性基因资源改良植物的抗旱性，是提高农作物产量的有效方法。植物对环境变化作出应激反应是基因水平调控和表观遗传调控的共同结果。microRNA分子作为一类非编码小分子，直接参与植物的生长、发育及对胁迫环境的耐受性。成熟的miRNA通过与祀mRNA的特定位点结合,引发mRNA的降解或抑制翻译来介导作用革巴基因的转录后沉默。microRNA作为细胞逆境应答的激活因子出现，特异的回应逆境胁迫。有研究指出玉米在盐胁迫下，高粱在干旱胁迫下均涉及大量microRNAs表达水平改变。大豆受干旱胁迫的microRNA基因调控研究亦是增强或改善大豆抗逆的焦点。MiRNA169是对干旱产生应答的一个重要小RNA，在大豆中共有21个家族成员。根据研究发现，在干旱处理条件下不同植物心TfVSP的表达具有差异。在水稻中，干旱处理下miR169g的表达下调，miR169gmiR169n是一个小RNA簇以串联形式存在，两者距离是3707bp。hniR169n(o)基因的上游有ABRE脱落酸响应元件说明则TtV你可能受到ABA的调控。在干旱渗透胁迫下则7 故汝.通过脱水响应元件DRE被诱导。NF-Y是一个可以和CCAAT box结合的一类蛋白复合体，是进化保守的转录因子。NF-Y核转录因子包括三个亚基，NF-YA，NF-YB，NF-YC，编码亚基的基因包含一个进化保守区域，负责和DNA结合。研究表明，番茄在受到干旱胁迫时Sly-miR169表达上调，所预测的三个靶基因(NF-YA1，NF-YA2,NF-YA3)的表达量明显下降，超表达幻你c番茄植株的气孔开放数量减少，降低了蒸腾作用叶片的水分损失率，抗干旱能力明显增强。专利技术目的 本专利技术的目的是提供一种大豆干旱调控相关的miciORNAs，大豆小RNA基因gma_miR169d。大豆小RNA基Mgma-miR169d,它包括碱基序列如序列表SEQ ID N0.1和/或2所不的基因。大豆小RNA基因例anTtV你￡/，它的碱基序列如序列表SEQ ID N0.3所示； 一种重组载体质粒，它是在RNA表达载体中插入大豆小RNA基因gmaidR169d ； 所述的表达载体为pBASTA-RD，它是用多克隆位点接头替换pEGAD载体中的EGFP(Ala)10基因序列构建而成 ； 所述的表达载体为P35S-N0S，它是用化学合成的MCS序列替换HBT-sGFP (S65T) -NOS载体 PST I (3978)和 Hind 111(3025)酶切位点间的 C4ppdklZm_sGFP(S65T)序列构建而成。大豆小RNA基因gma-miR169d在生产耐旱转基因植物中的应用。本专利技术提供了大豆小RNA基因gma_miR169d,它是利用Solexa测序技术获得了的microRNAs,分析结果表明，大豆小RNA基因gma-miR169d与大豆干旱调控相关，将含有gma-miR169d的成熟基因片段连接到载体上，并转入拟南芥，通过抑制拟南芥细胞内的靶基因的表达来进一步提高拟南芥对干旱的耐受能力。解决了转耐干旱基因操作涉及基因序列过长而遭遇转化困难等问题，该类干旱诱导的miRCToNA为小分子表达调控基因，且为大豆内源性microRNA,不编码产生蛋白。附图说明图1 HBT-sGFP (S65T)-NOS 载体图谱； 图2 p35S-N0S载体图谱； 图3大豆原生质共转化基因的表达水平分析图；A组转化p35S-N0S质粒；B 组转化 p35S-N0S-169d 质粒；C 组转化 HBT-sGFP (S65T)-NOS 质粒；D 组转化 HBT-sGFP (S65T)-N0S-NF-YA10 质粒；E 组共转化 p35S_N0S 和HBT-sGFP(S65T)-NOS ；F 组共转化 p35S-N0S_169d 和 HBT-sGFP(S65T)-NOS ;G 组共转化 P35S-N0S 和 HBT-sGFP (S65T)-N0S-NF-YA10 ；H 组共转化 p35S-N0S_169d 和HBT-sGFP(S65T)-NOS-NF-YAIO0图4 pBASTA-RD 载体图谱； 图5野生型和转基因拟南芥的发芽率对比； 图6野生型和转基因拟南 芥的叶片及根系生长状况。具体实施例方式本专利技术的前期研究结果显示采用大豆品种吉育72水培幼苗作为实验材料，在干旱诱导条件下，gma-miR169d表达水平增高。实施例1:gma_miR169d前体基因的克隆 以吉育72大S.品种(吉林省长春市新城大街2888号，邮编130118,吉林农业大学，农学院，王振民老师提供)为实验对象，进行水培。大豆种子使用灭菌蒸馏水清洗3次后，IX Hogland营养液水培，每2天更换一次培养液。设置对照组和处理组。待大豆培养至第2对复叶萌发后，处理组大豆使用2% PEG8000胁迫处理24h后，液氮冷冻材料，对照样组和PEG8000处理组提取总RNA。将大豆叶片使用液氮研磨成粉末后，将100 mg叶片干粉用小药匙转移至RNase-free的eppendorf离心管中，并加入I ml RNAiso Plus (购买自Takara),摇勻后室温静置5 min,4°C、12000rpm离心5min,将清液转入新的离心管中，加入200ul氯仿后盖紧离心管盖，震荡30 s，4°C U3000rpm离心5min，取上清，加入400 ul异丙醇，-20° C放置lh，4°C、13000rpm离心15min，沉淀用Iml 70%酒精洗涤2次，沉淀放超净工作台上吹干，用20 ul RNase-free水溶解，置于-80°C保存。总RNA反转录(BioTekesuper RT Kit购买自北京宝泰克生物技术有限公司)，得到的cDNA作为PCR模板。Gma-miR169d前体基因序列的PCR引物: miR169d Fl AGATTAGTGGATGTGAGCCAAG miR169d Rl TAAGAATAGTAAATAAGAACCPCR反应条件和体系:TaKaRa Ex Taq (5U/ul) 0.25ul ；10X Ex Taq Buffer 5ul ；dNTP Mixture (各2.5mM)4ul ;模板 cDNA 2.5ng ;引物 Fl( 10uM)2ul ;引物 Rl( 10uM)2ul ;灭菌蒸懼水 up to 50ul。95°C 5min ；95°C 30s, 60°C 30s, 72°C 30s (30 Cycles) ；72°C 7min。将扩增出的PCR产物连接克隆载体(pEASY-Tl Simple Cloning Kit，购自北京全式金生物技术有限公司)，得载体pEASY-Tl-169d，酶切鉴定后测序(金唯智生物科技本文档来自技高网...
【技术保护点】
大豆小RNA基因gma?miR169d，它包括碱基序列如序列表SEQ?ID?No.1和/或2所示的基因。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李海燕，董园园，尹海龙，刘伟灿，王法微，陈欢，王南，周颖，周永刚，赵利旦，
申请(专利权)人：吉林农业大学，
类型：发明
国别省市：
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