一种对水稻铜吸收和分配具有重要调控作用的蛋白OsSPL9及其编码基因与应用制造技术

本发明专利技术属于水稻遗传育种技术领域，涉及一种对水稻铜吸收和分配具有重要调控作用的蛋白OsSPL9及其编码基因与应用。本发明专利技术所提供的水稻OsSPL9蛋白及其编码基因在过表达的条件下，可引起水稻体内铜元素含量的增加。因此，通过基因工程的方法能利用该基因有效地调节水稻体内铜元素的含量，获得具有高含量有机铜的作物，对于增加饲料利用效率和减少环境污染均具有重要意义。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术设计一种通过过表达水稻OsSPL9基因增加水稻体内铜元素含量的方法及其在饲料中的应用。
技术介绍
微量元素是维持动物生命和生产不可缺少的营养素之一，具有重要的营养生理功能。铜是一种重要的微量元素，在动物生长繁殖、新陈代谢、机体造血、维持生长性能等方面具有不可替代的重要作用，是动物正常生长发育所必需的。在动物养殖中，铜元素(主要为硫酸铜)常常被添加到动物饲料中，作为生长促进剂和抗菌剂而使用。但无机铜对微量元素铁和锌具有拮抗作用，能导致锌和铁的排出量增加，造成动物体内铁和锌的缺乏；同时，粪便中残留的无机铜也会污染环境。另外，前人的研究表明动物对有机铜的利用效率比无机铜更高。因此，开展高效有机铜的研发，在促进动物生长的前提下，降低饲料中无机铜的添加量，减少或消除粪便中残留的铜对环境的污染具有重要意义。本申请专利通过转基因的手段，获得具有高含量有机铜的作物，对于增加饲料利用效率和减少环境污染均具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种通过过表达水稻基因OsSPL9增加水稻体内铜元素含量的方法及其在饲料中的应用。所述基因可为如下1)至4)中任一所述的DNA分子：1)序列表的序列2所示的DNA分子；2)序列表的序列3所示的DNA分子；3)与1)或2)限定的DNA序列具有90％以上同源性且过表达后增加植物体内铜元素含量的的DNA分子；4)在严格条件下与1)或2)或3)限定的DNA序列杂交且过表达后增加植物体内铜元素含量的的DNA分子。上述严格条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。含有所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属于本专利技术的保护范围。可用现有的植物表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端。使用所述基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本专利技术的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。也可不加任何选择性标记基因，直接根据表型筛选目的植物。扩增所述基因的全长或其任一片段的引物对也属于本专利技术的保护范围。本专利技术还保护一种培育转基因植物的方法，是将所述基因导入目的植物中，得到体内铜元素含量增加的转基因植物。所述基因具体可通过所述重组表达载体导入所述目的植物中。携带有所述基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导、基因枪等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。所述目的植物既可以是单子叶植物也可以是双子叶植物。本专利技术设计一种通过过表达水稻基因OsSPL9的方法，增加水稻体内铜元素含量方法及其在饲料中的应用。因此，通过基因工程的方法能利用该基因有效地调节、控制植物体内铜元素含量，在动物饲料的生产应用中具有重要意义。附图说明图1所示OsSPL9过表达载体。图2所示为转基因植株中的OsSPL9表达分析。图3所示为OsSPL9过表达转基因植株铜元素含量分析。图4所示为OsSPL9过表达转基因植物的田间数据分析。图5所示为OsSPL9过表达对COPT1、COPT5、COPT7表达的影响。图6所示为OsSPL9过表达对miR408、miR528的表达影响。具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本专利技术，但并不限定本专利技术。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次或以上重复实验，结果取平均值。实施例1 OsSPL9过表达转基因植株的获得AtSPL7基因是拟南芥中一个对于铜吸收和分配均具有重要调控作用的转录因子，在本研究中通过进化和共线性分析获得了AtSPL7在水稻的同源基因OsSPL9。通过PCR扩增获得OsSPL9的全长cDNA(F:CTAGAGGATCCCCGGGTACCATGGACGCCCCCGGCG，R:GATCGGGGAAATTCGAGCTCCTATGATGAGTAGTTCCTAG)，然后连接到由玉米Ubiquin启动子启动的载体pTCK303上(图1)，通过电击转入农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)株系LBA4404(Cat.No.18313-015，Invitrogen公司)中，获得了OsSPL9过表达转基因植株。实施例2 转基因植株中的OsSPL9表达分析为了检测转基因植株中OsSPL9基因的过表达水平，我们设计了OsSPL9特异引物(F:AATGCAGCTTCTGGAGAGGA，R:AGGCAGCGTTAAGCCATCTA)；取水稻幼苗提取RNA，进行荧光定量分析,将OsSPL9基因的荧光信号(以Ct值表示)与水稻基因UBC基因(内参基因)的荧光信号(以Ct值表示)根据公式(其中ΔCt＝Ct目的基因-Ct内参基因)计算出的值作为OsSPL9基因的相对表达量。结果表明，与对照材料日本晴相比，过表达株系OE2，OE19，OE23，OE30，OE32中OsSPL9基因的表达量都有2到4倍增加(图2)。实施例3 OsSPL9过表达转基因植株铜元素含量增加对过表达株系进行铜元素含量测定，样品经过5HNO3:1HClO4混合酸消化处理后，采用ICP-OES(Inductively Coupled Plasma-Optical Emission Spectroscopy)方法测定铜元素含量。我们发现在幼苗时期，地上部分包括叶片和叶鞘中铜元素均增加(图3a，3b)；在成熟期，过表达株系表现为种子中铜含量增加，而其他组织没有明显变化。通过过表达水稻OsSPL9基因，我们成功获得了铜含量增加的转基因水稻材料(图3c，3d)。实施例4 铜含量增加的OsSPL9过表达植株种子更易消化吸收为了验证铜含量增加的水稻种子是否更易消化吸收，我们参照Tang和Wang的方法，对野生型的种子和转基因种子进行了体外发酵实验(Tang,S.,Tan,Z.,Zhou,C.,Jiang,H.,Jiang,Y.and Sheng,L.(2006)A comparison of in vitro fermentation characteristics of different botanical fractions ofmaturemaize stover.J本文档来自技高网...

【技术保护点】
分离的、合成的或重组的DNA分子，其包括：(a) SEQ ID NO：2或3所示的序列；(b) DNA分子，其编码与SEQ ID NO：2或3所示序列所编码的多肽相比，具有一个或多个氨基酸残基的保守替代的多肽；(c)与SEQ ID NO：2或3所示的序列具有至少90%同源性的DNA分子或编码其酶活性片段的序列；(d) 在0.1×SSPE、 0.1×SSC或0.1％ SDS的溶液中，65℃条件下与(a) 、(b)、(c)中的DNA序列杂交、洗膜且过表达后的DNA分子；(e) 与SEQ ID NO：2或3所示序列互补的序列；(f) 由于遗传密码的简并性而衍生自SEQ ID NO：2或3所示序列的序列之一。

【技术特征摘要】
1.分离的、合成的或重组的DNA分子，其包括：(a) SEQ ID NO：2或3所示的序列；(b) DNA分子，其编码与SEQ ID NO：2或3所示序列所编码的多肽相比，具有一个或多个氨基酸残基的保守替代的多肽；(c)与SEQ ID NO：2或3所示的序列具有至少90%同源性的DNA分子或编码其酶活性片段的序列；(d) 在0.1×SSPE、 0.1×SSC或0.1％ SDS的溶液中，65℃条件下与(a) 、(b)、(c)中的DNA序列杂交、洗膜且过表达后的DNA分子；(e) 与SEQ ID NO：2或3所示序列互补的序列；(f) 由于遗传密码的简并性而衍生自SEQ ID NO：2或3所示序列的序列之一。2.分离的、合成的或重组的多肽，其包括：(a) SEQ ID NO：1所示的序列；(b)权利要求1所述DNA分子编码的氨基酸序列；(c)权利要求1所述DNA分子编码的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失和/或添加且与水稻体内铜元素含量相关的由(a)或(b)衍生的多肽。3.含有权利要求1所述DNA分子或权利要求2所述多肽的重组表达载体或表...

【专利技术属性】
技术研发人员：张德春，唐鸣凤，陈彩艳，毛东海，朱玉兴，刘成兵，
申请(专利权)人：三峡大学，中国科学院亚热带农业生态研究所，
类型：发明
国别省市：湖北;42