本发明专利技术涉及一种非小细胞肺癌中miRNA基因的应用。H1299细胞系中miR-96的一种靶基因CREB1，miR-96通过与靶基因mRNA的3′-UTR互补，抑制靶基因mRNA的翻译或直接降解靶基因的mRNA。本发明专利技术确定了在H1299细胞系中miR-96与CREB1有相互作用影响了H1299细胞的增殖、凋亡等生命活动。本发明专利技术通过软件预测、构建载体，再在HEK293T细胞中利用荧光素酶报告基因分析，初步验证了CREB1是miR-96的靶基因，接着在H1299细胞中利用过表达miR-96、qRT-PCR的技术，进一步验证了该发现。所公开的为在H1299细胞系中CREB1是miR-96的靶基因的首次报道，该发明专利技术在临床上为利用miRNA来诊断和治疗非小细胞肺癌，以及提供药物靶点方面提供了一定的应用价值。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种非小细胞肺癌中miRNA基因的应用。
技术介绍
微RNA (microRNA，miRNA )功能调控是当前生命科学的重要前沿。miRNA是一类长度为21-22 nt的非编码RNA分子，其通过转录后基因沉默调控靶基因的活性。对miRNA生物学功能及其调控的靶基因的研究表明，miRNA在肿瘤发生过程中起重要作用，miRNA很有可能成为癌症治疗的新途径。miRNA与靶基因mRNA的非编码序列(3' -UTR或5' -UTR)存在着一对多的关系。miRNA通常是在细胞核内由RNA聚合酶II转录，初级转录产物为pr1-miRNA,pr1-miRNA被核酸酶RNase III Drosha和其辅助因子Pasha加工成为发卡型前体miRNA (pre-miRNA),pre-miRNA被转运蛋白Exportin 5从细胞核输出到细胞质，之后被Dicer酶复合物剪切成为短的miRNA双链，在解旋酶的帮助下miRNA双链被解离，成熟的miRNA和RNA诱导的沉默复合体(R ISC)结合。miRNA与RISC的复合体通过碱基配对可与靶基因mRNA 3' -UTR中的互补序列相结合，随即依据miRNA与其靶基因序列的互补性高低，或是抑制蛋白质翻译，或是引发mRNA降解，从而负调控靶基因的表达。肺癌是导致全球癌症死亡的最主要原因，每年因肺癌死亡的人数超过100万，并且每年新增病例120万。肺腺癌(lung adenocarcinoma)是最常见的癌症,其中约80%的肺癌是非小细胞肺癌(non small cell lung cancer, NSCLC),其5年存活率仅为15%,主要原因是缺乏有效的针对肺癌的早期诊断和治疗手段。miRNA通过调控靶基因mRNA的翻译，在肺癌发生、发展及转移发挥重要作用。miRNA可能成为新的肺癌早期诊断和癌症进程相关的标记物，有助于疾病的准确诊断及个性化治疗。这一切设想的实现必须建立在miRNA靶基因功能研究工作的基础上。
技术实现思路
本专利技术的目的之一在于提供一种miR-96基因在抑制非小细胞肺癌癌细胞增殖中的应用。本专利技术的目的之二在于提供一种miR-96基因在促进非小细胞肺癌癌细胞凋亡中的应用。本专利技术的目的之三在于提供一种miR-96基因在H1299细胞系中下调CREBl表达水平的应用。本专利技术首先利用Solexa测序技术，利用qRT_PCR技术检测多种非小细胞肺癌系中miR-96的表达量变化，并从中选择一种miR-96表达下调最明显的非小细胞肺癌系，在此细胞系中过表达miR-96以检测其功能。细胞转染所用的转染试剂为Lipo2000(Invitrogen)。为了降低细胞密度、试剂用量及转染等因素造成的孔间差异，保证实验的可靠性和重复性，本实验中每个转染样品设置了 3个复孔。接种细胞时，每孔接种的细胞数量尽量保持一致，并且细胞在各孔的表面平均分布。细胞总RNA的提取采用生工生物公司的Trizol试剂。具体提取步骤如下: 丄J直接在培养板中加入Total RNA Extractor裂解细胞,每10 cm2面积加I ml TotalRNA Extractor，用移液器吹打混匀； ②将裂解后样品或匀浆液室温放置5-10min，使得核蛋白与核酸完全分离；③加入0.2ml氯仿,剧烈振荡15 sec,室温放置3 min。12, 000 rpm 4 °C离心10min ； 吸取水相转移至干净的离心管中，加入等体积异丙醇，混匀，室温放置20 min ； ⑤12,000 rpm 4 °C 离心 10 min,弃上清；⑥加入Iml 75%乙醇洗漆沉淀，12，000 rpm 4 V离心3 min,弃上清,室温干燥5-10min ；⑦加入30-50 1 RNase-free ddH20，充分溶解RNA，将所得到的RNA溶液置于-70 V 保存或用于后续试验。反转录PCR 米用 Takara 公司 One Step PrimeScript miRNA cDNA SynthesisKit。由于miRNA与mRNA不同,miRNA不具有Poly (A)结构,但本转录试剂盒可以同时对样品中的miRNA以及它的small non-coding RNA进行Poly(A)加尾反应,然后利用UniversalAdaptor Primer将经过加尾的RNA以及mRNA进行反转录反应得到cDNA,并引入UniniRqPCR Primer的结合位点，利用这一位置对样品中任何cDNA进行定量PCR反应。用来检测的仪器为Bio-Rad公司的iQ5系统，试剂为TaKaRa公司的SYBR Green Mix。这种试剂里面含有Taq DNA聚合酶，dNTP mix, SYBR Green dye。U6用来作为内参基因。本实验所用到的引物为:miR-96 引物 Forward:5' - TTTGGCACTAGCACATTTTTGCT-3'，Reverse:为 Un1-miR qPCR primer ；U6 引物为 Forward:5' -CTCGCTTCGGCAGCACA- 3'，Reverse:5' -AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。第二步，利用CCK8技术和流式细胞仪技术，分别检测过表达miR-96后H1299细胞的增殖和凋亡情况的变化。非小细胞肺癌H1299细胞被培养在含有10%胎牛血清的1640培养基中。CO2培养箱中含有5% 0) 2并且湿润，温度为37°C。为了降低细胞密度、试剂用量及转染等因素造成的孔间差异，保证实验的可靠性和重复性，本实验中每个转染样品设置了 3个复孔。接种细胞时，每孔接种的细胞数量尽量保持一致，并且细胞在各孔的表面平均分布。转染步骤如下:①转染非小细胞肺癌细胞的前一天，接种适当数量的细胞至培养板中，每孔加入不含抗生素的培养基，使转染时的细胞密度能够达到50%。转染时，细胞密度是影响转染效率的关键因素之一，细胞生长过度会削弱细胞活力，降低细胞的转染效率一准备mimic-lipo2000混合液:a.稀释miRNA mimic:用50 1不含血清培养基Opt1-MEM稀释miRNA mimics,使加入细胞中的终浓度为50 nmol/L,轻轻混勻，室温孵育5 min ；b.稀释lipo2000:用60 1不含血清的Opt1-MEM稀释I 1 lipo2000，轻轻混匀并室温孵育5 min ；c.将a与b轻轻混勻，室温孵育20 min。注意:稀释好的lipo2000长时间放置可能导致转染试剂活性的降低，应尽量在25 min之内与稀释好的mimics混合。在混合试剂时，不能剧烈吹打或震荡，手指轻弹管壁即可，过度用力可能会破坏脂质体的结构和miRNA-mimics-lipo2000混合物的形成；③将miRNA-mimics-lipo2000混合液加入含有细胞及培养液的培养孔中，轻轻混匀；④将培养板置于37°C的CO2培养箱中48 h。培养6 h后，将孔里含有mimics-1 ipo2000混合液的培养基移去，更换新鲜培养基。本实验采用D0JIND0公司的CCK8 (Cell Counting Kit_8)试剂盒。该试剂盒利用了水溶性四锉盐-WST-8 (2-本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种miR?96基因在抑制非小细胞肺癌癌细胞增殖中的应用。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：金由辛，侯品品，申雨晴，王德韬，马中良，韦嘉励，
申请(专利权)人：上海大学，
类型：发明
国别省市：
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