本发明专利技术公开了一种检测结核分枝杆菌异烟肼耐药突变的引物、探针、试剂盒及方法，属于结核分枝杆菌耐药突变的检测技术领域。所述检测结核分枝杆菌异烟肼耐药突变的引物和探针，包括检测用引物和荧光探针。所述试剂盒包括：核酸提取反应液、PCR反应液、对照试剂、核酸提取反应液、PCR反应液和对照试剂。所述试剂盒检验方法包括以下步骤：（1）制备试剂（2）样品采集及处理（3）加样（4）PCR扩增（5）结果分析及判断。所述引物和探针灵敏度高且特异性好，所述试剂盒成本低廉，所述检测方法具有不开盖同步实施、不易污染、结果更可靠、操作简便快捷并可定量等优点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及结核分枝杆菌耐药突变的检测
，特别涉及。
技术介绍
结核病是由结核分枝杆菌感染引起的慢性传染病，结核菌可侵入人体全身各种器官，但主要侵犯肺脏，成为肺结核病。根据世界卫生组织2009年的报告，目前全球有三分之一的人口感染结核分枝杆菌，每年新增病人超过900万，其中42万为多耐药结核，死亡200万，我国是世界上22个结核病高负担国家之一，患病人数仅次于印度居全球第二位，我国结核病耐药情况严重，耐药率高达27.8%，给结核病的预防和治疗构成严峻挑战，异烟肼(isoniazid, INH)是20世纪50年代开始用于临床的酰肼类化学合成药，是结核病合并治疗的一线核心药物，也是结核分枝杆菌隐性感染的首选药物。到目前为止，较多文献报道它是一种前体药物，在菌体内被katG基因编码的过氧化氢酶-过氧化物酶激活，作用于细胞壁分枝菌酸合成途径中的酶系而干扰分枝菌酸的生物合成，最终导致菌体细胞壁损伤而死亡，异烟肼耐药相关突变主要发生在KatG315位点，inhA94位点，inhA启动子区和ahpC启动子区(除-46位点)。现有的检测结核病的方法主要为基因检测，由于结核菌耐药的产生主要是基因组DNA中抗结核药物作用靶基因突变所致，因此基因检测更为直接，基因检测法的基本过程为先扩增耐药相关基因，然后分析扩增产物，结核耐药位点分散、突变类型多样，针对该特点，近年来出现了如液相芯片法、MLPA (Multiplex Ligation-Dependent ProbeAmplification,多重连结依赖探针扩增)以及焦磷酸测序等高通量筛查技术应用于结核耐药突变分析的报道。在实现本专利技术的过程中，专利技术人发现现有技术至少存在以下问题:对于液相芯片法、MLPA技术以及焦磷酸测序等高通量筛查技术应用于结核耐药突变，这些方法虽然检出率高，但是成本也高，而且PCR后处理步骤复杂，增加了产物污染的几率，提高了对实验室及人员的要求。
技术实现思路
为了解决上述现有技术中存在的问题，本专利技术实施例提供了。所述技术方案如下:—方面，一种检测结核分枝杆菌异烟肼耐药突变的引物和探针，包括检测用引物和荧光探针，所述检测用引物和荧光探针包括katG基因的正向引物、katG基因的野生型正向引物、katG基因的第一突变型正向引物、katG基因的第二突变型正向引物、katG基因的反向引物、katG基因的 荧光探针、inhA基因的正向引物、inhA基因的野生型正向引物、inhA基因的突变型正向引物、inhA基因的反向引物和inhA基因的突光探针,具体序列为:所述katG基因的正向引物katG-F如序列表中SEQ ID NO:1所示；所述katG基因的野生型正向引物katG-Fw如序列表中SEQ ID N0:2所示；所述katG基因的第一突变型正向引物katG-Fm-1如序列表中SEQ ID N0:3所示；所述katG基因的第二突变型正向引物katG-Fm-2如序列表中SEQ ID N0:4所示；所述katG基因的反向引物katG-R如序列表中SEQ ID N0:5所示；所述katG基因的突光探针katG_P如序列表中SEQ ID NO:6所示；所述inhA基因的正向引物inhA-F如序列表中SEQ ID N0:7所示；所述inhA基因的野生型正向引物inhA-Fw如序列表中SEQ ID NO:8所示；所述inhA基因的突变型正向引物inhA-Fm如序列表中SEQ ID NO:9所示；所述inhA基因的反向引物inhA-R如序列表中SEQ ID NO: 10所示；所述inhA基因的突光探针inhA_P如序列表中SEQ ID NO: 11所示。可选地，所述荧光探针的5’端连接有荧光基团，所述荧光基团为FAM、ROX、HEX、CY5、CY3、TET、ALEX或CAL Flour，所述荧光探针的3’端连接有淬灭基团，所述淬灭基团为BHQl、BHQ2 或DABCYL。优选地，所述katG基因的荧光探针katG-P和inhA基因的荧光探针inhA_P的5’端均连接有所述荧光基团FAM，所述katG基因的荧光探针katG-P和inhA基因的荧光探针inhA-P的3’端均连接有所述淬灭基团BHQl。另一方面，本专利技术提供一种检测结核分枝杆菌异烟肼耐药突变的试剂盒，所述试剂盒具有如上所述检测用弓I物和所述荧光探针。进一步地，所述试剂盒还包括:核酸提取反应液、PCR反应液和对照试剂；所述核酸提取反应液为TB DNA提取液；所述PCR反应液包括TB酶混合液和INH PCR Mix A ;所述对照试剂包括INH阳性对照和TB阴性对照。进一步地，所述INH阳性对照为INH野生型质粒；所述TB阴性对照为质量分数为0.09%的生理盐水；所述TB DNA提取液包括ImM乙二胺四乙酸二钠、IOmMTris和10%Triton-100o具体地，所述INH PCR Mix A 包括 IXPCR Buffer,3.5mM MgCl2、0.8mM dNTPs、0.4 μ MdUTP、0.8 μ M正向引物、0.8 μ M所述katG基因的正向引物、0.8 μ M所述katG基因的野生型正向引物、0.8 μ M所述katG基因的第一突变型正向引物、0.8 μ M所述katG基因的第二突变型正向引物、0.8μΜ所述katG基因的反向引物、0.2μΜ所述katG基因的荧光探针、0.8 μ M所述inhA基因的正向引物、0.8 μ M所述inhA基因的野生型正向引物、0.8 μ M所述inhA基因的突变型正向引物、0.8μ M所述inhA基因的反向引物和0.2 μ M所述inhA基因的突光探针。进一步地，所述TB包括2.5U Taq酶和0.5U UNG酶。再一方面，本专利技术提供一种试剂盒的检测方法，所述方法包括以下步骤:(I)制备试剂:在室温条件下，取η X44 μ L所述INH PCR Mix A和nX I μ L所述TB酶混合液加入第一支离心管中，振荡混匀，3000rpm离心30s得到上清液，将所述上清液分装于PCR反应管中；(2)样品 采集及处理:取痰标本，加所述痰标本1-3倍体积的IM NaOH溶液，对所述痰标本进行15min的液化,吸出ImL经液化后的所述痰标本置于1.5mL离心管内，IOOOOrpm离心15min得到第一滤渣，向所述第一滤渣中加800 μ L TE洗涤液，经13000rpm离心IOmin后得到第二滤渣，向所述第二滤洛中加300 μ L裂解液,并于99°C加热20min,再经过13500rpm离心IOmin得到第一上清液，将所述第一上清液移入1.5mL离心管中，所述第一上清液即为PCR扩增模板DNA，保存于-20°C ；(3)加样:向每支所述PCR反应管中加入所述PCR扩增模板DNA、TB阴性对照和INH阳性对照品5 μ L，进行PCR扩增，并进行扩增反应；(4) PCR扩增:其扩增程序为:50°C,2min ；95°C,3min ；95°C，25s ;59°C，55s，10 个循环;95°C，15s ;57°C，40s，40 个循环;(5)结果分析及判断:若katG基因的长片段目标DNA的Ct>36，且inhA基因的长片段目标DNA的Ct>36，则目标DN本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测结核分枝杆菌异烟肼耐药突变的引物和探针，其特征在于，包括检测用引物和荧光探针，所述检测用引物和荧光探针包括katG基因的正向引物、katG基因的野生型正向引物、katG基因的第一突变型正向引物、katG基因的第二突变型正向引物、katG基因的反向引物、katG基因的荧光探针、inhA基因的正向引物、inhA基因的野生型正向引物、inhA基因的突变型正向引物、inhA基因的反向引物和inhA基因的荧光探针，具体序列为：所述katG基因的正向引物katG?F如序列表中SEQ?ID?NO:1所示；所述katG基因的野生型正向引物katG?Fw如序列表中SEQ?ID?NO:2所示；所述katG基因的第一突变型正向引物katG?Fm?1如序列表中SEQ?ID?NO:3所示；所述katG基因的第二突变型正向引物katG?Fm?2如序列表中SEQ?ID?NO:4所示；所述katG基因的反向引物katG?R如序列表中SEQ?ID?NO:5所示；所述katG基因的荧光探针katG?P如序列表中SEQ?ID?NO:6所示；所述inhA基因的正向引物inhA?F如序列表中SEQ?ID?NO:7所示；所述inhA基因的野生型正向引物inhA?Fw如序列表中SEQ?ID?NO:8所示；所述inhA基因的突变型正向引物inhA?Fm如序列表中SEQ?ID?NO:9所示；所述inhA基因的反向引物inhA?R如序列表中SEQ?ID?NO:10所示；所述inhA基因的荧光探针inhA?P如序列表中SEQ?ID?NO:11所示。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：唐景峰，柳建银，程弘夏，霍然，
申请(专利权)人：武汉百泰基因工程有限公司，
类型：发明
国别省市：
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