本发明专利技术涉及一种检测MTHFR基因化疗药物相关SNP位点的引物组及其方法。其中引物组包括第一引物组和第二引物组，第一引物组的的正向引物为SEQ?ID?NO:3所示序列，反向引物为SEQ?ID?NO:4所示序列；第二组引物的正向引物为SEQ?ID?NO:5所示序列，反向引物为SEQ?ID?NO:6所示序列。这本发明专利技术的有益效果在于本发明专利技术的技术方法是一种体外检测方法，对人体无害；本发明专利技术通过测序技术检测样本MTHFR基因677位点和1298位点的基因型，对拟使用化疗药物5-氟尿嘧啶或氨甲喋呤的病人进行个体化用药指导，可提高疗效，降低毒副作用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及检测基因化疗相关SNP位点引物组及方法，特别是一种检测MTHFR基因化疗药物相关SNP位点的引物组及方法。
技术介绍
单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP),主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。它是人类可遗传的变异中最常见的一种。占所有已知多态性的90%以上。SNP在人类基因组中广泛存在，平均每500 1000个碱基对中就有I个，估计其总数可达300万个甚至更多。SNP所表现的多态性只涉及到单个碱基的变异，这种变异可由单个碱基的转换(transition)或颠换(transversion)所引起，也可由碱基的插入或缺失所致。一般而言，SNP是指变异频率大于1%的单核苷酸变异。SNP成为第三代遗传标志，人体许多表型差异、对疾病、毒物的易感性与耐受性，疾病临床表现的多样性(clinicalphenotype diversity),以及对药物治疗的反应性上都起着重要的作用。亚甲基四氢叶酸还原酶(methylenetetrahydorfolatereductase, MTHFR)是叶酸代谢过程中的关键酶，可将5，10- 二甲基四氢叶酸(5，10-MTHF)转变为5-甲基四氢叶酸(5-MTHF)。5，10-MTHF是胸苷酸合成的重要原料之一，参与DNA的合成与修复；而5-MTHF是体内主要的甲基供体，参与DNA甲基化过程。MTHFR对于DNA的合成、活化及修复有着重要的调控作用。合成该酶基因中的SNP位点——677位点和1298位点的多态性会影响到酶活性，进而影响叶酸正常代谢，导致一系列的反应。所以检测MTHFR基因677位点和1298位点的多态性可作为化疗药物治疗疗效和毒副作用的良好预测指标。MTHFR基因的多 态性影响到5_氟尿嘧啶(5_fIuorouracil，5-FU)的化疗效果。5-氟尿嘧啶为嘧啶类似物，属于抗代谢药的一种，对消化道癌及其他实体瘤有良好疗效。进入体内后，它需经过酶转化为5-氟脱氧尿嘧啶核苷酸而具有抗肿瘤活性。5-氟尿嘧啶能抑制胸腺嘧啶核苷酸合成酶，阻断脱氧嘧啶核苷酸转换成胸腺嘧啶核苷核，干扰DNA合成和修复。对RNA的合成也有一定的抑制作用。研究表明，MTHFR酶活性降低将造成体内5，10-MTHF的浓度升高，5-MTHF水平随之下降，进而提高5-氟尿嘧啶抗肿瘤疗效。MTHFR基因的677位T/T基因型携带者化疗有效率显著高于T/C和C/C基因型携带者，1298位A/A基因型携带者化疗有效率也明显优于于A/C和C/C基因型携带者。MTHFR基因的多态性也与氨甲喋呤(methotrexate，MTX)药物的毒副作用存在相关性。氨甲喋呤是叶酸拮抗剂，能抑制MTHFR作用，在多种肿瘤疾病，如急性淋巴细胞白血病，恶性淋巴瘤、头颈部癌、乳腺癌、恶性葡萄胎、绒毛膜上皮癌等的化疗中发挥重要作用。但在治疗过程中，患者常出现不良反应，包括胃肠道反应、骨髓移植和肝功能损害等。研究发现，MTHFR基因的677位T/T基因型携带者对氨甲喋呤治疗的毒性反应比C/C的基因型携带者严重。不同人群对于同样药物的代谢和效应存在着个体化差异，这样的差异是由人的不同基因型所决定的。对于肿瘤患者人群，采用一致的化疗治疗手段可能导致药物疗效和副作用在不同个体上差异很大。因此，如果先检测个体的基因型，再根据检测结果制定相应的个体化用药治疗方法，能够提高疗效，减轻毒副作用和患者负担。这也是当代疾病治疗的发展方向。
技术实现思路
本专利技术的目的在于，提供一种检测MTHFR基因化疗药物相关SNP位点的引物组及方法，可测定MTHFR基因677位点和1298位点的基因型，进而为评估化疗药物5-氟尿嘧啶和氨甲喋呤对于受检者的疗效和毒副作用的依据，可用于个体化用药指导。一种检测MTHFR基因化疗药物相关SNP位点的引物组，包括第一引物组和第二引物组，第一引物组的的正向引物为SEQ ID NO: 3所示序列，反向引物为SEQ ID NO:4所示序列；第二组引物的正向引物为SEQ ID N0:5所示序列，反向引物为SEQ ID N0:6所示序列。检测MTHFR基因化疗药物相关SNP位点的方法，包括:(I)采集待检测血液样本，提取基因组DNA ；(2)对待检测样本DNA中的MTHFR基因677位点扩增，所用PCR引物为上述引物组的第一组引物；(3)对待检测样本DNA中的MTHFR基因1298位点扩增，所用PCR引物为上述引物组的第二组引物；(4)对PCR反应产物进行测序，分析测序结果，确定677位点和1298位点基因型。更进一步的，上述 PCR反应产物测序前进行正向测序反应扩增、纯化后变性，在正向测序扩增反应时，MTHFR基因677位点正向引物(MTHFR-677F)为SEQ ID NO:3所示序列，MTHFR基因1298位点正向引物(MTHFR-1298F)为SEQ ID NO:5所示序列。本专利技术相关引物特性如下:本专利技术中用于扩增MTHFR基因677位点的PCR引物，其中正向引物MTHFR-677F的3’末端位于如序列SEQ ID NO:1所示的MTHFR基因第4外显子上游约35bp处；反向引物MTHFR-677R的3’末端位于如序列SEQ ID NO:1所示的MTHFR基因第4外显子下游约18bp处。正反向引物大小分别为19bp，18bp，并能完全扩增MTHFR基因677位点所在区域。SEQIDNO:1给出了 MTHFR基因第4外显子的基因序列，677位点位于该外显子第79bp处。本专利技术中用于扩增MTHFR基因1298位点的PCR引物，其中正向引物MTHFR-1298F的3’末端位于如序列SEQ ID N0:2所示的MTHFR基因第7外显子上游约17bp处；反向引物MTHFR-1298R的3’末端位于如序列SEQ ID NO: 2所示的MTHFR基因第7外显子下游约155bp处。正反向引物大小分别为18bp，19bp，并能完全扩增MTHFR基因1298位点所在区域。SEQ ID NO: 2给出了 MTHFR基因第7外显子的基因序列，1298位点位于该外显子第120bp 处。本专利技术的特点在于，包括:(i)本专利技术的技术方法是一种体外检测方法，对人体无害；(ii)本专利技术通过测序技术检测样本MTHFR基因677位点和1298位点的基因型，对拟使用化疗药物5-氟尿嘧啶或氨甲喋呤的病人进行个体化用药指导，可提高疗效，降低毒副作用。附图说明图1本专利技术引物序列设计示意图。图2检测所设计的引物组特异性的实验电泳图。如图所示，泳道A1、B1、C1、D1分别为4个DNA模板的MTHFR基因677位点经特异扩增后电泳结果；泳道A2、B2、C2、D2分别为4个DNA模板的MTHFR基因1298位点经特异扩增后电泳结果；泳道El为MTHFR基因677位点空白对照PCR扩增后电泳结果；泳道E2为MTHFR基因1298位点空白对照PCR扩增后电泳结果；Marker代表TAKARA DLl, 000DNA分子量标准。图3样本MTHFR基因677位点和1298位点PCR扩增后的电泳图。如图所示，泳道I为样本DNA的MTHFR基因677位点PCR扩增后电泳结果；泳道2为样本DNA的M本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测MTHFR基因化疗药物相关SNP位点的引物组，包括第一引物组和第二引物组，第一引物组的的正向引物为SEQ?ID?NO:3所示序列，反向引物为SEQ?ID?NO:4所示序列；第二组引物的正向引物为SEQ?ID?NO:5所示序列，反向引物为SEQ?ID?NO:6所示序列。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：陈然，郝玮，孙黎，李小青，周蕊，梁超，韩韬，陈忠，方国伟，涂赞兵，黄士昂，
申请(专利权)人：武汉康圣达医学检验所有限公司，
类型：发明
国别省市：
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