一种检测风疹病毒的荧光定量PCR试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种检测风疹病毒的荧光定量PCR试剂盒，该试剂盒包括PCR反应液、内标、阳性质控品和阴性质控品，所述PCR反应液包括用于检测风疹病毒RNA的上游引物、下游引物和荧光探针，所述内标和阳性质控品分别为含沙眼衣原体色氨酸合成酶β亚基编码基因的RNA假病毒和含风疹病毒特异性保守基因片段的RNA假病毒。本发明专利技术试剂盒可以检测我国风疹流行病学中公布的风疹病毒所有基因型，采用假病毒作为内标，能够真实有效地对可能造成的假阴性检测结果进行质控，大大提高了其检测灵敏度、准确度和稳定性。

A fluorescence quantitative PCR kit for detection of rubella virus

【技术实现步骤摘要】
一种检测风疹病毒的荧光定量PCR试剂盒
本专利技术涉及病毒基因检测领域，尤其涉及一种检测风疹病毒的荧光定量PCR试剂盒。
技术介绍
风疹病毒(Rubellavirus，RV)是披膜病毒科(Togaviridae)风疹病毒属(Rubellavirusgenus)中的唯一成员，与披膜病毒科的其它病毒无交叉抗原。RV是单股正链RNA病毒，经呼吸道传染，人是其唯一的自然宿主，呈世界性分布。风疹本身并不严重，但RV对公众健康最大的威胁是它的致畸性。孕妇，特别是妊娠早期的孕妇，感染风疹病毒可导致胎儿先天性风疹综合症(Congenitalrubellasyndrome，CRS)。风疹病毒会通过胎盘引起胎儿感染，可在胎儿的某些组织细胞中进行繁殖，但并不杀死细胞，最终导致胎儿组织器官分化、形成发生异常，引起风疹综合征，如白内障、视网膜色素沉着、小眼球、角膜浑浊、神经性耳聋、先天性心脏病、小头、前囟门不闭合、智力低下等先天畸形；并导致胎儿死亡几率增大、宫内生长迟缓、出生时体重低、出生后发育缓慢、孤僻等不良后果。显而易见，风疹病毒的感染与优生有着密切的关系。因此研究该病毒的基因结构及其感染特征并对患者作出早期、及时、准确、快速的诊断，对于推行优生优育、提高人口素质和搞好妇幼保健都是极其重要的，是优生优育的重要课题。目前最常用的风疹病毒检测方法是酶联免疫吸附试验(ELISA)，它是基于抗原抗体反应的特异性和酶促反应的敏感性而建立的现代免疫学方法，用于快速检测患者血清中风疹病毒特异性IgM抗体，可用来确定急性风疹感染。但对未注射风疹疫苗及对再次风疹感染的病人，无法确定IgM抗体滴度增高的原因，同时对于初次急性期感染的诊断和控制传染源的扩散不利。为提高风疹IgM抗体检测的准确性，应该在出疹后8～28天采集血清，而在出疹1～4天内的检出率较低。因此，ELISA检测风疹病毒IgM抗体存在一定的漏诊，尤其是无法判断胎儿的感染情况(胎儿在妊娠期18～20周之前通常不产生IgM抗体)，以及某些免疫抑制病人或先天性感染病人也可能不产生IgM抗体。并且风疹疫苗的推广使用或在再次风疹感染期IgM抗体滴度比较高，不利于初次急性期感染的诊断和控制；而在自身免疫性疾病病人中抗体检测有可能产生假阳性。随着现代核酸技术的发展，建立在基因水平上的实时荧光定量PCR技术由于其高灵敏性和高特异性，在临床检测中得到广泛应用。荧光定量PCR技术主要包括核酸提取和扩增两个部分，其中核酸提取是至关重要的第一步。病毒是核酸与蛋白的复合体，蛋白质外壳里面装有DNA或RNA遗传物质。病毒核酸的提取都有一个裂解的过程，而纯的核酸像PCR产物、克隆的质粒、人工合成的核酸片段是不经过这一过程的，所以无法真正体现病毒核酸的提取过程，也就不能够真正实现质控品的意义。现有的运用荧光定量PCR方法进行风疹病毒检测技术的缺点主要有以下几点：(1)没有涵盖我国常见风疹病毒的所有基因型，因此存在漏诊的情况；(2)大多数情况下样本反应管中未设置内对照(内标)以对管内抑制扩增可能造成的假阴性结果进行质控，即使设置了内标，也一般为质粒DNA，不能真实有效地反映病毒RNA的提取过程；(3)扩增产物容易受到实验室气溶胶污染，检测结果会有出现假阳性。
技术实现思路
有鉴于此，为克服现有技术缺陷，本专利技术提出了一种检测风疹病毒的荧光定量PCR试剂盒，可检测出我国风疹流行病学中公布的所有基因型，操作简便快捷，检测灵敏度高、检测范围广，为诊断风疹感染提供可靠的实验依据。本专利技术的技术方案是这样实现的：本专利技术提供了一种检测风疹病毒的荧光定量PCR试剂盒，包括PCR反应液、内标、阳性质控品和阴性质控品，所述PCR反应液包括用于检测风疹病毒的上游引物1、下游引物1和荧光探针1：上游引物1碱基序列为5’-TGCAGATGGCGCCCAGAGTGAG-3’(SEQIDNO.1)，下游引物1碱基序列为5’-ACCGGCGTGGTGTATGGCACAC-3’(SEQIDNO.2)；荧光探针1碱基序列为5’-TGGGCAGCAGCCCACTCCGCCC-3’(SEQIDNO.3)，荧光探针1的5’端标记第一荧光基团，荧光探针1的3’端标记能够淬灭第一荧光基团发射的荧光信号的第一淬灭基团；所述内标为含沙眼衣原体色氨酸合成酶β亚基编码基因的RNA假病毒。在以上技术方案的基础上，优选的，所述内标核酸碱基序列如序列表中SEQIDNO.7所示。在以上技术方案的基础上，优选的，所述PCR反应液还包括用于检测内标的上游引物2、下游引物2和荧光探针2：上游引物2碱基序列为5’-ACGAGCCTTTTATACATTAGCCA-3’(SEQIDNO.4)，下游引物2碱基序列为5’-TGTGAAGACTCCAATGCAGGA-3’(SEQIDNO.5)；荧光探针2碱基序列为5’-CCACCGATGAAGAGGCGTTACGAGC-3’(SEQIDNO.6)，荧光探针2的5’端标记第二荧光基团，荧光探针2的3’端标记能够淬灭第二荧光基团发射的荧光信号的第二淬灭基团。在以上技术方案的基础上，优选的，所述阳性质控品为含风疹病毒特异性保守基因片段的RNA假病毒。进一步，优选的，所述阳性质控品核酸碱基序列如序列表中SEQIDNO.8所示。在以上技术方案的基础上，优选的，所述上游引物1与荧光探针1浓度比以及下游引物1与荧光探针1浓度比均为(1-4):1。在以上技术方案的基础上，优选的，所述上游引物1和下游引物1浓度均为0.2-0.5μM，所述荧光探针1浓度为0.1-0.3μM。在以上技术方案的基础上，优选的，所述PCR反应液还包括逆转录酶、RNA酶抑制剂、TaqDNA聚合酶和dNTPs，所述逆转录酶浓度为1-3U/μL，所述RNA酶抑制剂浓度为0.2-1U/μL，所述TaqDNA聚合酶浓度为0.1-0.3U/μL，所述dNTPs浓度为0.1-4mM。在以上技术方案的基础上，优选的，所述PCR反应液还包括UNG酶和dUTP，所述UNG酶浓度为0.004-0.1U/μL，所述dUTP浓度为0.1-4mM。本专利技术的检测风疹病毒的荧光定量PCR试剂盒相对于现有技术具有以下有益效果：(1)本专利技术通过NCBI在线对我国风疹流行病学中公布的所有风疹病毒基因型(1E型、1F型、2A型、2B型)的序列进行比对分析，选择其高度保守区域，设计了特异性引物和探针，确保能够检测全部我国出现的RV基因型，适用于定性或定量检测全血、血清、血浆或羊水等多种样本类型中的风疹病毒RNA；(2)病毒检测最理想的质控品就是它本身，但由于其具有致病性，考虑到生物安全性问题，不可能直接采用病毒作为质控品，所以本专利技术模拟天然病毒的形态，通过基因工程手段构建出含有目的核酸片段与包装蛋白形成的复合体(假病毒)，首次在RV荧光检测中引入了RNA假病毒的内标和外标，RNA是非常不稳定的，在提取过程中极容易降解，让内标与待测样本同时参与核酸提取过程，能够本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测风疹病毒的荧光定量PCR试剂盒，包括PCR反应液、内标、阳性质控品和阴性质控品，其特征在于，所述PCR反应液包括用于检测风疹病毒的上游引物1、下游引物1和荧光探针1：/n上游引物1碱基序列为5’-TGCAGATGGCGCCCAGAGTGAG-3’，/n下游引物1碱基序列为5’-ACCGGCGTGGTGTATGGCACAC-3’；/n荧光探针1碱基序列为5’-TGGGCAGCAGCCCACTCCGCCC-3’，/n荧光探针1的5’端标记第一荧光基团，荧光探针1的3’端标记能够淬灭第一荧光基团发射的荧光信号的第一淬灭基团；/n所述内标为含沙眼衣原体色氨酸合成酶β亚基编码基因的RNA假病毒。/n

【技术特征摘要】
1.一种检测风疹病毒的荧光定量PCR试剂盒，包括PCR反应液、内标、阳性质控品和阴性质控品，其特征在于，所述PCR反应液包括用于检测风疹病毒的上游引物1、下游引物1和荧光探针1：
上游引物1碱基序列为5’-TGCAGATGGCGCCCAGAGTGAG-3’，
下游引物1碱基序列为5’-ACCGGCGTGGTGTATGGCACAC-3’；
荧光探针1碱基序列为5’-TGGGCAGCAGCCCACTCCGCCC-3’，
荧光探针1的5’端标记第一荧光基团，荧光探针1的3’端标记能够淬灭第一荧光基团发射的荧光信号的第一淬灭基团；
所述内标为含沙眼衣原体色氨酸合成酶β亚基编码基因的RNA假病毒。


2.如权利要求1所述的检测风疹病毒的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：所述内标核酸碱基序列如序列表中SEQIDNO.7所示。


3.如权利要求1所述的检测风疹病毒的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，所述PCR反应液还包括用于检测内标的上游引物2、下游引物2和荧光探针2：
上游引物2碱基序列为5’-ACGAGCCTTTTATACATTAGCCA-3’，
下游引物2碱基序列为5’-TGTGAAGACTCCAATGCAGGA-3’；
荧光探针2碱基序列为5’-CCACCGATGAAGAGGCGTTACGAGC-3’，
荧光探针2的5’端标记第二荧光基团，荧光探针2的3’端标记能够淬...

【专利技术属性】
技术研发人员：熊慧，杨雪婷，肖樊，许威，李志杰，瞿佳莉，高峰英，刘姣荣，
申请(专利权)人：武汉百泰基因工程有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42