快速检测鲤疱疹病毒Ⅱ型的RAA扩增引物和探针及检测试剂盒与使用方法技术

本发明专利技术公开了一种快速检测鲤疱疹病毒Ⅱ型的RAA扩增引物和探针及检测试剂盒与使用方法。本发明专利技术的RAA等温扩增体系，反应快速，温度范围宽，在34～40℃条件下均可实现靶基因的有效扩增，其最低检出限为8.14×10

Rapid detection of carp herpesvirus type \u2161 by RAA amplification primers, probes, detection kits and application methods

【技术实现步骤摘要】
快速检测鲤疱疹病毒Ⅱ型的RAA扩增引物和探针及检测试剂盒与使用方法
本专利技术涉及水产养殖业水生动物疫病领域，尤其是一种快速检测鲤疱疹病毒Ⅱ型的RAA扩增引物和探针及检测试剂盒与使用方法。
技术介绍
鲤疱疹病毒Ⅱ型(Cyprinidherpesvirus2，CyHV-2)是感染金鱼和鲫(Carassiusauratus)引起造血器官坏死病的高致病性病原，严重危害金鱼、鲫等鱼类养殖业。病毒侵染鱼类的鳃、肾、脾组织，被感染的鱼行动迟缓、腹部膨大、体表和鳍条基部出血。1995年该病毒首次在日本养殖的金鱼体内被分离到，之后迅速蔓延至美国、澳洲、英国等国家和中国台湾地区。该病毒传入我国后，在我国鲫主养区大规模暴发流行，造成养殖金鱼和鲫的大批死亡，产生巨大经济损失。建立准确、快速地现场检测方法，是有效防控该病的前提。目前在CyHV-2检测上应用最广泛的是PCR和荧光PCR，此外还有病毒分离方法、免疫组化方法和血涂片。但这些方法均有一定的局限性：能分离病毒的细胞系有待改进，单克隆抗体基础上建立的免疫组化方法有待验证。为了更好地通过检测，尽早发现潜在病毒感染，以便采取积极防控措施，控制疾病扩散，建立快速、简便和适用于现场检测CyHV-2的新方法，作为现有方法的有力补充。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是，提供一种快速检测鲤疱疹病毒Ⅱ型的RAA扩增引物和探针及检测试剂盒与使用方法，具有灵敏度高、特异性强、可视化、操作方法简单、无需昂贵设备等优点。为了解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案是：一种快速检测鲤疱疹病毒Ⅱ型的RAA扩增引物和探针，包含下述核苷酸序列的一对引物和探针：上游引物：RAA-F：5’-ATCTTCAAGCCCAAGATCAATCACAATAAC-3’SEQIDNO:1下游引物：RAA-R：5’-AAACACTTGAGTTTGATATTTTAGTACGC-3’SEQIDNO:2探针：Probe：5’-ACGAGCGTAGAAAGTTTGCAGCCGTGGTCGTCAACGGTTCAAGCA-3’SEQIDNO:3。所述下游引物在5’端修饰Biotin。所述探针的5’端标记FAM，中间位置采用四氢呋喃THF替代一个碱基，3’端进行C3spacer处理。含有上述快速鲤疱疹病毒Ⅱ型的RAA扩增引物和探针的快速检测鲤疱疹病毒Ⅱ型试剂盒。所述试剂盒为重组酶介导扩增试剂盒，含有上述RAA扩增引物和探针、核酸快速检测侧向流试纸条、鲤疱疹病毒Ⅱ型helicase基因阳性对照样品和阴性对照样品、RAA干粉试剂、水解缓冲液ABuffer及醋酸镁溶液BBuffer。上述快速检测鲤疱疹病毒Ⅱ型试剂盒的使用方法，包含以下步骤：(1)在RAA冻干酶粉中加入40.9μL水解缓冲液ABuffer，10μM、2μL鲤疱疹病毒Ⅱ型上游引物SEQIDNO:1，10μM、2μL鲤疱疹病毒Ⅱ型下游引物SEQIDNO:2，10μM、0.6μL鲤疱疹病毒Ⅱ型探针SEQIDNO:3，2μL模板，在反应管盖上加280mM、2.5μL醋酸镁BBuffer，上下颠倒反应管使之充分混匀后瞬离；恒温37℃反应10min；(2)反应：将步骤(1)恒温反应后的产物用核酸快速检测试纸条检测，3-5min观察结果；(3)结果判读：直接肉眼判读①阴性：仅在质控线出现条带，在检测线处无条带出现，说明所检测的样品没有鲤疱疹病毒Ⅱ型感染；②阳性：质控线和检测线均出现条带，证明所检测的样品为鲤疱疹病毒Ⅱ型感染；③无效：质控线和检测线均无条带出现，表明试验不成功，核酸快速检测试纸条失效。本专利技术的有益效果是：本专利技术的RAA等温扩增体系，反应快速，温度范围宽，在34～40℃条件下均可实现靶基因的有效扩增，本专利技术的试剂盒能快捷、高效、灵敏的检测CyHV-2，具有操作简单，特异性高，且反应结果易于观察，安全无污染等特点，不仅为CyHV-2感染核酸的现场快速检测筛查提供有效的技术手段，同时对于控制CyHV-2在金鱼和鲫感染传播及在疫区、出入境口岸的检验检疫也具有非常重要的意义。附图说明图1为CyHV-2的RAA检测引物筛选的凝胶结果图(1：第一组引物；2：第二组引物；3：第三组引物；4：第四组引物)；图2为RAA-LFD法对CyHV-2的灵敏度实验图(1.阴性对照；2-10为8.14×100-8.14×108的阳性标准品的扩增结果)；图3是本专利技术引物特异性测试图(1：阴性对照；2：CyHV-2的helicase基因阳性质粒对照；3：传染性造血器官坏死病病毒(IHNV)核酸；4：鲤春病毒血症病毒(SVC)核酸；5：草鱼出血病病毒(GV-9014)核酸；6：鲤浮肿病毒(CEV)核酸；7：锦鲤疱疹病毒病(KHV)核酸；8：流行性造血器官坏死病毒(EHNV)核酸；9：斑点叉尾鮰病毒(CCV)核酸)。具体实施方式下面结合附图和具体实施方式对本专利技术作进一步详细说明：以下实施例中所用的材料、试剂等，无特殊说明，均为常规方法。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。以下实例中RAA扩增试剂盒购自杭州众测生物科技有限公司。以下实例中便携式核酸快速检测侧向流试纸条(LFD)为杭州优思达生物技术有限公司产品。以下实例中病毒基因组DNA提取试剂盒购自QIAGEN公司。以下实例中的引物及探针均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。以下实施例中CyHV-2的helicase基因阳性质粒根据GenBank公布的序列(Genebank号：MK260012.1和KU199244.1)进行合成并克隆在pEASY-T1载体，作为本专利技术试剂盒的标准品。实施例1CyHV-2的RAA-LFD快速检测试剂盒的建立1.CyHV-2的RAA引物及探针的设计及合成以NCBI数据库中CyHV-2的helicase基因保守区域为靶位点，依据RAA引物设计原则，采用DNAman6.0软件进行序列比对分析，选取同源性高的片段，用primerprimer5.0设计了4对引物(如表1)。表1RAA所用的引物2.CyHV-2RAA检测引物筛选以CyHV-2阳性质粒(8.14×106copies/μL)为模板进行扩增，反应结束后，用2％的琼脂糖电泳鉴定(见图1)，对设计引物进行筛选，筛选出最优引物对为第3组引物，其最优引物对为F及R：上游引物：RAA-GFHNV-3-F：5’-ATCTTCAAGCCCAAGATCAATCACAATAAC-3’SEQIDNO:1下游引物：RAA-GFHNV-3-R：5’-AAACACTTGAGTTTGATATTTTAGTACGC-3’SEQIDNO:23.CyHV-2RAA-LFD试剂盒的建立本专利技术所述的CyHV-2RAA-LFD试剂盒包本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种快速检测鲤疱疹病毒Ⅱ型的RAA扩增引物和探针，其特征在于，包含下述核苷酸序列的一对引物和探针：/n上游引物：/nRAA-F：5’-ATCTTCAAGCCCAAGATCAATCACAATAAC-3’SEQ ID NO:1下游引物：/nRAA-R：5’-AAACACTTGAGTTTGATATTTTAGTACGC-3’SEQ ID NO:2探针：/nProbe：5’-ACGAGCGTAGAAAGTTTGCAGCCGTGGTCGTCAACGGTTCAAGCA-3’SEQ ID NO:3。/n

【技术特征摘要】
1.一种快速检测鲤疱疹病毒Ⅱ型的RAA扩增引物和探针，其特征在于，包含下述核苷酸序列的一对引物和探针：
上游引物：
RAA-F：5’-ATCTTCAAGCCCAAGATCAATCACAATAAC-3’SEQIDNO:1下游引物：
RAA-R：5’-AAACACTTGAGTTTGATATTTTAGTACGC-3’SEQIDNO:2探针：
Probe：5’-ACGAGCGTAGAAAGTTTGCAGCCGTGGTCGTCAACGGTTCAAGCA-3’SEQIDNO:3。


2.根据权利要求1所述快速检测鲤疱疹病毒Ⅱ型的RAA扩增引物和探针，其特征在于，所述下游引物在5’端修饰Biotin。


3.根据权利要求1所述快速检测鲤疱疹病毒Ⅱ型的RAA扩增引物和探针，其特征在于，所述探针的5’端标记FAM，中间位置采用四氢呋喃THF替代一个碱基，3’端进行C3spacer处理。


4.含有权利要求1-3任一项所述快速鲤疱疹病毒Ⅱ型的RAA扩增引物和探针的快速检测鲤疱疹病毒Ⅱ型试剂盒。


5.根据权利要求4所述快速检测鲤疱疹病毒Ⅱ型试剂盒，其特征在于，所述试剂盒为重组酶介导扩增试剂盒...

【专利技术属性】
技术研发人员：吕晓楠，王姝，徐立蒲，张文，曹欢，王静波，王小亮，
申请(专利权)人：北京市水产技术推广站，
类型：发明
国别省市：北京;11