鲤浮肿病毒和锦鲤疱疹病毒三重PCR检测方法技术

本发明专利技术公开了一种鲤浮肿病毒和锦鲤疱疹病毒三重PCR检测方法，该方法包括以下步骤：第一、选择与合成引物：选择扩增CEV P4a基因548bp片段，KHV TK基因409bp片段和KHV Sph基因292bp片段的3对特异性引物；第二、制备标准品：提取鲤浮肿病毒和锦鲤疱疹病毒的DNA，合成CEV P4a基因序列548bp片段，克隆到pEASY‑T1载体；合成KHV TK基因序列409bp片段和KHV Sph基因序列292bp片段，克隆到PUC57‑Kan载体上，构建CEV‑P4a、KHV‑TK和KHV‑Sph标准质粒，根据质粒浓度计算拷贝数；第三、确定三重PCR退火温度及优化引物浓度。

Triple PCR detection of carp puffiness virus and Koi herpesvirus

【技术实现步骤摘要】
鲤浮肿病毒和锦鲤疱疹病毒三重PCR检测方法
本专利技术涉及一种鲤浮肿病毒和锦鲤疱疹病毒三重PCR检测方法，属于鱼类病毒检测

技术介绍
锦鲤是我国主要观赏鱼养殖品种之一，在观赏鱼国际贸易中占较大比重，具有重要的经济价值。随着我国锦鲤养殖规模的不断扩大，疫病的频繁出现也制约了观赏鱼养殖产业的发展。锦鲤对多种病原易感，据研究可引起锦鲤大面积死亡的主要病原是鲤浮肿病毒(Carpedemavirus，CEV)和锦鲤疱疹病毒(Kioherpesvirus，KHV)。CEV是大小约为200nm×400nm的双链DNA，属痘病毒。KHV是直径167～200nm的双链DNA，属疱疹病毒。这两种病毒引起的临床症状极其相似，包括烂鳃、眼球凹陷等，死亡率高达80％～100％。因此，当养殖锦鲤出现烂鳃、凹眼等症状，并有较高死亡率时，根据现场调查症状和流行特点很难区分这两种病毒病，还需尽快进行实验室检测。分子生物学方法是实验室最常用的检测CEV和KHV的方法。对于CEV，Oyamatsu等建立了nest-PCR方法，该方法适合于锦鲤的检测。对于KHV，PCR检测方法是OIE水生动物疾病诊断手册上优先推荐的方法。目前，实验室通常采用SC/T7212.1-2011行业标准同时扩增TK基因和Sph基因来检测该病毒。鉴于CEV和KHV引起的发病锦鲤症状极其相似，针对同一临床样品需要分别检测CEV和KHV这两种病原，为提高实验室检测效率，尽快确诊病原，本专利技术建立了可同时检测锦鲤样品中CEV和KHV的三重PCR检测方法，为CEVD和KHVD这两种常见鱼类疫病的快速诊断及有效防控提供必要的科学依据。
技术实现思路
本专利技术为了解决上述问题，提供一种新型的鲤浮肿病毒和锦鲤疱疹病毒三重PCR检测方法，该方法能够同时检测CEV和KHV，提高了检测效率。本专利技术所述的鲤浮肿病毒和锦鲤疱疹病毒三重PCR检测方法包括以下步骤：第一、选择与合成引物：选择扩增CEVP4a基因548bp片段，KHVTK基因409bp片段和KHVSph基因292bp片段的3对特异性引物；第二、制备标准品：提取鲤浮肿病毒和锦鲤疱疹病毒的DNA，合成CEVP4a基因序列548bp片段，克隆到pEASY-T1载体；合成KHVTK基因序列409bp片段和KHVSph基因序列292bp片段，克隆到PUC57-Kan载体上，构建CEV-P4a、KHV-TK和KHV-Sph标准质粒，根据质粒浓度计算拷贝数；第三、确定三重PCR退火温度及优化引物浓度：单重PCR扩增反应的反应程序为：95℃预变性4min，95℃变性1min，适宜温度退火1min，72℃延伸1min，35个循环后72℃延伸10min；在单重PCR反应条件基础上，分别加入质粒CEV-P4a、KHV-TK和KHV-Sph各2.5μL作为模板，退火温度设置为43℃、45℃、47℃、49℃、51℃、53℃、55℃、57℃、59℃、61℃、63℃、65℃进行三重PCR扩增，根据条带强弱确定最佳退火温度；在此基础上，设置每对引物终浓度为0.1μmol/L、0.2μmol/L、0.3μmol/L、0.4μmol/L、0.5μmol/L、0.6μmol/L6个梯度，组合后分别进行三重PCR扩增，根据条带强弱、有无杂带确定最佳引物终浓度。优选地，单重PCR扩增反应的反应体系确定为：2×MasterMix25μL，10μmol/L的Primer-R的体积为2μL，10μmol/L的Primer-F的体积为2μL，模板的体积为2μl，补DEPC水至50μL。在一个实施例中，扩增CEVP4a基因548bp片段的特异性引物CEV-R的序列为TGCAGGTTGCTCCTAATCCT。在一个实施例中，扩增CEVP4a基因548bp片段的特异性引物CEV-F的序列为GCTGTTGCAACCATTTGAGA。在一个实施例中，扩增KHVTK基因409bp片段的特异性引物TK-R的序列为CACCCAGTAGATTATGC。在一个实施例中，扩增KHVTK基因409bp片段的特异性引物TK-F的序列为GGGTTACCTGTACGAG。在一个实施例中，扩增KHVSph基因292bp片段的特异性引物Sph-R的序列为GACACATGTTACAATGGTCGC。在一个实施例中，扩增KHVSph基因292bp片段的特异性引物Sph-F的序列GACACCACATCTGCAAGGAG。在一个实施例中，优化好的反应体系为：2×MasterMix25μL，3对特异性引物终浓度0.3μmol/L，模板2.5μL，补DEPC水至50μL。反应程序为：95℃预变性4min，95℃变性1min，53℃退火1min，72℃延伸1min，35个循环后72℃延伸10min。以10倍系列稀释的质粒CEV-P4a、KHV-TK和KHV-Sph作为模板，分别进行三重PCR检测，结果显示质粒CEV-P4a、KHV-TK和KHV-Sph的检测限均为300copies/μL。与现有技术相比，本专利技术所述的鲤浮肿病毒和锦鲤疱疹病毒三重PCR检测方法的有益效果在于：本专利技术选取可分别扩增CEVP4a基因的548bp片段，KHVTK基因的409bp片段和KHVSph基因的292bp片段的3对特异性引物进行组合，同时考虑多重PCR扩增过程中的影响因素，优化了退火温度和引物浓度，进行了敏感性和特异性试验。结果显示，该方法能特异的扩增出3条目的条带，大小分别是548bp、409bp和292bp，最佳退火温度为53℃，50μL的反应体系中引物浓度均为0.3μmol/L。该方法对CEV和KHV的检测限均为300copies/μL，同时与其它水生动物病毒均无交叉反应。因此，本专利技术建立的方法可用于锦鲤样品中CEV和KHV的快速检测。附图说明图1是不同退火温度三重PCR扩增的示意图。图2是单重PCR敏感性试验的示意图。图3是三重PCR敏感性试验的示意图。图4是任意两种质粒作为模板三重PCR扩增的示意图。图5是特异性试验的示意图。具体实施方式以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。本专利技术所述的鲤浮肿病毒和锦鲤疱疹病毒三重PCR检测方法包括以下步骤：第一、选择与合成引物：选择扩增CEVP4a基因548bp片段，KHVTK基因409bp片段和KHVSph基因292bp片段的3对特异性引物，引物序列见表1，由北京六合华大基因科技有限公司合成。表1引物序列第二、制备标准品：提取鲤浮肿病毒和锦鲤疱疹病毒的DNA，送至北京天成新脉生物技术有限公司，合成CEVP4a基因序列(548bp)，克隆到pEASY-T1载体。合成KHVTK基因序列(409bp)和KHVSph基因序列(292bp)，克隆到PUC57-Kan载体上，构建CEV-P4a、KHV-TK和KHV-Sph标准质粒，根据质粒浓度计算拷贝数本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种鲤浮肿病毒和锦鲤疱疹病毒三重PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：/n第一、选择与合成引物：/n选择扩增CEV P4a基因548bp片段，KHV TK基因409bp片段和KHV Sph基因292bp片段的3对特异性引物；/n第二、制备标准品：/n提取鲤浮肿病毒和锦鲤疱疹病毒的DNA，合成CEV P4a基因序列548bp片段，克隆到pEASY-T1载体；合成KHV TK基因序列409bp片段和KHV Sph基因序列292bp片段，克隆到PUC57-Kan载体上，构建CEV-P4a、KHV-TK和KHV-Sph标准质粒，根据质粒浓度计算拷贝数；/n第三、确定三重PCR退火温度及优化引物浓度：/n单重PCR扩增反应的反应程序为：95℃预变性4min，95℃变性1min，适宜温度退火1min，72℃延伸1min，35个循环后72℃延伸10min；/n在单重PCR反应条件基础上，分别加入质粒CEV-P4a、KHV-TK和KHV-Sph各2.5μL作为模板，退火温度设置为43℃、45℃、47℃、49℃、51℃、53℃、55℃、57℃、59℃、61℃、63℃、65℃进行三重PCR扩增，根据条带强弱确定最佳退火温度；在此基础上，设置每对引物终浓度为0.1μmol/L、0.2μmol/L、0.3μmol/L、0.4μmol/L、0.5μmol/L、0.6μmol/L6个梯度，组合后分别进行三重PCR扩增，根据条带强弱、有无杂带确定最佳引物终浓度。/n...

【技术特征摘要】
1.一种鲤浮肿病毒和锦鲤疱疹病毒三重PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
第一、选择与合成引物：
选择扩增CEVP4a基因548bp片段，KHVTK基因409bp片段和KHVSph基因292bp片段的3对特异性引物；
第二、制备标准品：
提取鲤浮肿病毒和锦鲤疱疹病毒的DNA，合成CEVP4a基因序列548bp片段，克隆到pEASY-T1载体；合成KHVTK基因序列409bp片段和KHVSph基因序列292bp片段，克隆到PUC57-Kan载体上，构建CEV-P4a、KHV-TK和KHV-Sph标准质粒，根据质粒浓度计算拷贝数；
第三、确定三重PCR退火温度及优化引物浓度：
单重PCR扩增反应的反应程序为：95℃预变性4min，95℃变性1min，适宜温度退火1min，72℃延伸1min，35个循环后72℃延伸10min；
在单重PCR反应条件基础上，分别加入质粒CEV-P4a、KHV-TK和KHV-Sph各2.5μL作为模板，退火温度设置为43℃、45℃、47℃、49℃、51℃、53℃、55℃、57℃、59℃、61℃、63℃、65℃进行三重PCR扩增，根据条带强弱确定最佳退火温度；在此基础上，设置每对引物终浓度为0.1μmol/L、0.2μmol/L、0.3μmol/L、0.4μmol/L、0.5μmol/L、0.6μmol/L6个梯度，组合后分别进行三重PCR扩增，根据条带强弱、有无杂带确定最佳引物终浓度。


2.如权利要求1所述的鲤浮肿病毒和锦鲤疱疹病毒三重PCR检测方法，其特征在于，单重PCR扩增反应的反应体系确定为：2×MasterMix25μL，10μmol/L的Primer-R的体积为2μL，10μmol/L的Primer-F的体积为2μL，模板的体积为2μL，补DEPC水至50μL。


3.如权利要求2所述的鲤浮肿病毒和锦鲤疱疹病毒三重PCR检测方法，其特征在于，扩增CEVP4a基因548bp片段的特异性引物...

【专利技术属性】
技术研发人员：张文，徐立蒲，吕晓楠，王姝，王小亮，王静波，曹欢，
申请(专利权)人：北京市水产技术推广站，
类型：发明
国别省市：北京;11