用于检测新型冠状病毒的引物组合物、试剂盒和方法技术

本发明专利技术涉及用于检测新型冠状病毒的引物组合物、试剂盒和方法。所述引物组合物包括用于检测新型冠状病毒N基因的第一引物对和第二引物对，以及用于检测新型冠状病毒ORF1ab基因的第三引物对和第四引物对。采用该引物组合物，以待测样品的基因组DNA为模板，在例如胸腺嘧啶DNA糖基化酶、MLV反转录酶和Bst DNA聚合酶的作用下进行恒温扩增反应，并且在荧光染料的作用下对待测结果进行定量分析，能够以高特异性、高灵敏度检测新型冠状病毒。本发明专利技术由于使用了四条引物，加上对引物的碱基进行特殊修饰，并在反应中加入胸腺嘧啶DNA糖基化酶和Bst DNA聚合酶，能够在恒温的条件下实现对N基因和ORF1ab基因目标序列的指数级扩增，极大地提高了检测的灵敏度和特异性。

Primer composition novel coronavirus, kit and method for detecting novel coronavirus

【技术实现步骤摘要】
用于检测新型冠状病毒的引物组合物、试剂盒和方法
本专利技术属于分子生物学领域，涉及用于检测新型冠状病毒的引物组合物，本专利技术还涉及使用所述引物组合物用于检测新型冠状病毒的试剂盒及方法。
技术介绍
冠状病毒(Coronavirus)归类于病毒目(Nidovirales)冠状病毒科(Cirinaviridae)。冠状病毒的基因组为一条完整的单股正链RNA，长约30Kb，是RNA病毒中最长的RNA核酸链。由于冠状病毒基因组大而复杂，其转录过程比较复杂。各种冠状病毒的基因组有所不同，在其非编码区可分别发生不同的变异而改变调控功能。编码区可编码不同的功能蛋白，再加上RNA病毒的复制酶缺少校正功能，使得病毒在自然界动物体内复制过程中发生重组与变异的机率高，因此会出现新的或再现的冠状病毒株。新型冠状病毒肺炎(Novelcoronaviruspneumoia，NPC)就是一种新出现的对人致病的且传染性强的疾病。新冠肺炎的感染者会出现发热、乏力、干咳等症状。少数患者伴有鼻塞、流涕、咽痛和腹泻等症状。重症患者在发病一周后会出现呼吸困难或低氧血症，严重者会本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于检测新型冠状病毒的引物组合物，其包括用于检测新型冠状病毒N基因的第一引物对和第二引物对，以及用于检测新型冠状病毒ORF1ab基因的第三引物对和第四引物对；/n其中所述第一引物对由与新型冠状病毒N基因的保守序列的上游端和下游端互补的一对引物组成，而且所述第一引物对中的每一引物从5’端到3’端依次包含修饰部分和未修饰部分；在所述修饰部分中，与未修饰部分相邻的第1至4个常规DNA碱基中的至少一个被替换成非常规DNA碱基；所述第二引物对中的每一引物分别与第一引物对中的每一引物的修饰部分相同；/n其中所述第三引物对由与新型冠状病毒ORF1ab基因的保守序列的上游端和下游端互补的一对引物组成，...

【技术特征摘要】
1.一种用于检测新型冠状病毒的引物组合物，其包括用于检测新型冠状病毒N基因的第一引物对和第二引物对，以及用于检测新型冠状病毒ORF1ab基因的第三引物对和第四引物对；
其中所述第一引物对由与新型冠状病毒N基因的保守序列的上游端和下游端互补的一对引物组成，而且所述第一引物对中的每一引物从5’端到3’端依次包含修饰部分和未修饰部分；在所述修饰部分中，与未修饰部分相邻的第1至4个常规DNA碱基中的至少一个被替换成非常规DNA碱基；所述第二引物对中的每一引物分别与第一引物对中的每一引物的修饰部分相同；
其中所述第三引物对由与新型冠状病毒ORF1ab基因的保守序列的上游端和下游端互补的一对引物组成，而且所述第三引物对中的每一引物从5’端到3’端依次包含修饰部分和未修饰部分；在所述修饰部分中，与未修饰部分相邻的第1至4个常规DNA碱基中的至少一个被替换成非常规DNA碱基；所述第四引物对中的每一引物分别与第三引物对中的每一引物的修饰部分相同。


2.权利要求1所述的引物组合物，其中所述非常规DNA碱基选自：5-羧基胞嘧啶(5caC)、乙烯基胞嘧啶(EthenoC)、乙烯基腺嘌呤(EthenoA)、3-甲基腺嘌呤(3-MeA)、7-甲基腺嘌呤(7-MeA)、3-甲基鸟嘌呤(3-MeG)、7-甲基鸟嘌呤(7-MeG)、N6-甲基腺嘌呤(m6A)、次黄嘌呤、脱氧次黄嘌呤、8-氧鸟嘌呤(8-oxoG)，及其任意组合；优选地，所述非常规DNA碱基为5-羧基胞嘧啶(5caC)。


3.权利要求1或2所述的引物组合物，其中所述修饰部分和未修饰部分的长度分别为12-50个碱基，优选分别为18-40个碱基；优选地，所述非常规DNA碱基的数量为2-15个，优选为3个。


4.权利要求1至3中任一项所述的引物组合物，其中所述用于检测新型冠状病毒N基因的第一引物对和第二引物对选自：
SEQIDNO：1和3表示的第一引物对，和SEQIDNO：2和4表示的第二引物对；
SEQIDNO：5和7表示的第一引物对，和SEQIDNO：6和8表示的第二引物对；或
SEQIDNO：9和11表示的第一引物对，和SEQIDNO：10和12表示的第二引物对；
优选地，所述用于检测新型冠状病毒N基因的第一引物对和第二引物对为：
SEQIDNO：5和7表示的第一引物对，和SEQIDNO：6和8表示的第二引物对；
所述用于检测新型冠状病毒ORF1ab的第三引物对和第四引物对选自：
SEQIDNO：13和15表示的第三引物对，和SEQIDNO：14和16表示的第四引物对；
SEQIDNO：17和19表示的第三引物对，和SEQIDNO：18和20表示的第四引物对；或
SEQIDNO：21和23表示的第三引物对，和SEQIDNO：22和24表示的第四引物对；
优选地，所述用于检测新型冠状病毒ORF1ab的第三引物对和第四引物对为：
SEQIDNO:21和23表示的第三引物对，和SEQIDNO：22和24表示的第四引物对。


5.一种用于检测新型冠状病毒的试剂盒，其包括权利要求1至4中任一项所述的引物组合物、识别并切除双链DNA中的一条链内的非常规DNA碱基的酶、识别RNA并对其进行反转录合成cDNA的逆转录酶和具有链置换功能的DNA聚合酶。


6.权利要求5所述的试剂盒，其中所述识别并切除双链DNA中的一条链内的非常规DNA碱基的酶为DNA糖基化酶和/或核酸内切酶V；优选地，所述DNA糖基化酶选自：胸腺嘧啶DNA糖基化酶(TDG)、甲基嘌呤DNA糖基化酶(AAG)、8-羟基鸟嘌呤糖基化酶1(OGG1)、8-氧鸟嘌呤DNA糖基化酶(Fpg)，及其任意组合；
所述识别RNA并对其进行反转录合成cDNA的逆转录酶为AMV反转录酶和/或MLV反转录酶；
所述具有链置换功能的DNA聚合酶选自：Phi29DNA聚合酶、BstDNA聚合酶、PyroPhage3137DNA聚合酶、Vent聚合酶、9°Nm聚合酶、KlenowDNA聚合酶、缺少3’-5’外切酶...

【专利技术属性】
技术研发人员：蒋健晖，王海波，唐丽娟，
申请(专利权)人：湖南融健基因生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖南;43