一种检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的引物探针组及检测方法技术

技术编号:24325501 阅读:40 留言:0更新日期:2020-05-29 17:58
本发明专利技术提供一种检测新型冠状病毒SARS‑CoV‑2的引物探针组及检测方法,属于分子生物学检测技术领域。本发明专利技术提供的RT‑RAA荧光法检测新型冠状病毒SARS‑CoV‑2的引物探针组包括上游引物、下游引物和探针,所述上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示,所述探针为在SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的第31位碱基修饰荧光报告基团、第32位碱基替换为四氢呋喃残基和第34位碱基修饰淬灭基团的物质。本发明专利技术提供的引物探针组检测快速、准确、灵敏、操作简便,特异性达100%,能够在30min内完成对新型冠状病毒SARS‑CoV‑2的检测。

Detection novel coronavirus SARS-CoV-2 primer probe and detection method

【技术实现步骤摘要】
一种检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的引物探针组及检测方法
本专利技术涉及病毒检测
,特别是涉及用于检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的特异性引物和探针组,本专利技术还涉及利用该引物和探针进行新型冠状病毒检测的方法和试剂盒。
技术介绍
2020年2月11日,国际病毒分类委员会的冠状病毒研究小组(CSG)在医学类预印本发布平台medRxiv发表最新关于新型冠状病毒命名的论文,正式将新冠病毒从“2019-CoV”,正式命名为“SARS-CoV-2”。冠状病毒有包膜,颗粒呈圆形或椭圆形,经常为多形性,直径50-200nm。S蛋白位于病毒表面形成棒状结构,作为病毒的主要抗原蛋白之一,是用于分型的主要基因。N蛋白包裹病毒基因组,可用作诊断抗原。冠状病毒按血清型可分为α、β、γ和δ四个属,新型冠状病毒SARS-CoV-2属于β属。冠状病毒的理化特性为:对热敏感,56℃30分钟、乙醚、75%乙醇、含氯消毒剂、过氧乙酸和氯仿等脂溶剂均可有效灭活病毒。核酸检测是现阶段用于确诊新型冠状病毒肺炎的主要手段之一。目前对新型冠状病毒的核酸检测手段主要是RT-PCR法,此方法以其较高的特异性及敏感性在新型冠状病毒检测方面发挥着重大作用。但是RT-PCR方法由于其变温的特点需要相关的昂贵复杂仪器设备且需要有专业技术人员操作,现有的新型冠状病毒SARS-CoV-2的RT-PCR检测方法需要现场进行反应体系的配制,反应程序也分为两个步骤,第一个步骤为50-55℃30分钟以上的逆转录和40到90分钟的扩增检测时间,整体核酸扩增检测根据不同的试剂盒需要的时间在1.5-3小时,因此在基层和现场的检测应用受到很大限制,受检测速度及检测人员的限制,会导致大量疑似病例的样本积压,不能快速得到结果。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种操作简单、耗时短、易于操作的快速荧光检测新型冠状病毒SARS-CoV-2核酸的引物探针组及检测方法。本专利技术通过对已公布的新型冠状病毒SARS-CoV-2的全序列共包含10个基因进行综合分析比较,为达到快速筛查的目的,实现快速、灵敏,准确检测这三个基本要求,从10个基因中选择保守性最优的ORF1ab基因序列进行设计引物探针,且为了更快更准的检测出新型冠状病毒SARS-CoV-2,针对ORF1ab基因进行单一基因检测,减少检测多重基因的干扰,提高扩增速度和检测灵敏度;具体设计运用DNAMAN软件进行冠状病毒同源性分析和b1ast序列分析,筛出新型冠状病毒保守度及特异性俱佳的基因序列,为了筛选出最优的引物探针,进行多区间设计,共设计了46对特异性引物探针供筛选。通过筛选,优选出灵敏度10拷贝/测试的引物探针组,共为5个组合;在这5个组合的基础上用新型冠状病毒SARS-CoV-2毒株培养物核酸进一步进行适应性筛选,选出灵敏度最高的一组引物探针组。具体而言,第一方面,本专利技术提供了一种用于检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的特异性引物探针组,包括上游引物、下游引物和探针,所述上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示,所述下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示,所述探针为如SEQIDNO.3所示的核苷酸序列。上游引物:5’-CACGTAGGAATGTGGCAACTTTACAAGCTG-3’(SEQIDNO.1);下游引物:5’-CTTAGGTATGCCAGGTATGTCAACACATAAAC-3’(SEQIDNO.2);5’-TAACAGGACTCTTTAAAGATTGTAGTAAGGTAATCACTGGGTTACAT-3’(SEQIDNO.3)。优选地,所述探针为在SEQIDNO.3所示核苷酸序列的第31位碱基修饰荧光报告基团、第32位碱基替换为四氢呋喃残基和第34位碱基修饰荧光淬灭基团的物质。本专利技术的探针第31位碱基修饰的荧光报告基团为FAM、HEX、TET、JOE、VIC、ROX、Cy3或Cy5;优选为FAM或HEX。所述荧光淬灭基团为TAMRA、Eclipse、BHQ1、BHQ2、BHQ3或DABCYL;优选为BHQ1或BHQ2。含有上述特异性引物探针组的试剂盒属于本专利技术的保护范围。第二方面,本专利技术提供一种检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的RT-RAA荧光检测试剂盒,该试剂盒含有上述特异性引物探针组。所述试剂盒中,上游引物浓度为0.02-0.05mM,下游引物浓度为0.02-0.05mM;优选上游引物浓度为0.03mM,下游引物浓度为0.03mM。本专利技术所述试剂盒中,探针浓度为0.01-0.03mM,优选0.02mM。本专利技术所述试剂盒其工作程序是以待测样品基因组RNA为模板,利用特异性引物探针组,进行RT-RAA荧光扩增,根据荧光信号判定结果。扩增检测在等温条件下温度为37-42℃,优选39℃,扩增检测时间为10-15min。第三方面,本专利技术提供了一种检测新型冠状病毒的SARS-CoV-2的RT-RAA荧光检测方法,以待测样品基因组RNA为模板,利用特异性引物探针组,进行RT-RAA荧光扩增,根据荧光信号判定结果。具体步骤为:将5μL的新型冠状病毒SARS-CoV-2RNA样本加入到45μL扩增体系中,将配制好的扩增体系与新型冠状病毒SARS-CoV-2RNA在等温条件39℃下,放入恒温振荡混匀仪中混匀后,放入恒温荧光检测仪,荧光检测仪设置为:检测时间10分钟,温度39℃,在等温扩增过程中用荧光探针法对扩增产物进行实时检测,监测到有荧光信号放大为阳性,说明存在新型冠状病毒SARS-CoV-2RNA。本专利技术提供了一种快速荧光检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的扩增体系,所述扩增体系包括反应单元及反应缓冲液两部分;所述的反应缓冲液中含有新型冠状病毒SARS-CoV-2特异性引物探针组;本专利技术所述反应缓冲液是在江苏奇天基因生物科技有限公司提供的货号为F00R01试剂盒中的通用反应缓冲液中加入本申请所述的特异性引物探针组配制而成,反应缓冲液中组份为:上游引物、下游引物、探针、Tris-HCl缓冲液、MgAc和PEG20000;所述反应单元江苏奇天基因生物科技有限公司提供的货号为F00R01试剂盒中的通用反应单元,主要包括以下组分:ATP、dNTPs、重组酶、单链结合蛋白、核酸外切酶、DNA聚合酶、逆转录酶。用50μL的移液器吸取本专利技术所述的反应缓冲液加入冻干反应单元中配制成扩增体系,再加入1-5μL的新型冠状病毒SARS-CoV-2RNA样本,在等温条件下,混匀并进行逆转录4~10min后,放入荧光检测仪中进行实时检测。优选的,所述新型冠状病毒SARS-CoV-2RNA的检测方法加样体积为1~5μL,浓度为1~50ng/μL,更优的加样量为5μL。优选的,所述等温扩增在恒温条件下进行,所述等温扩增的温度为37~42℃,更优的为39℃。优选的,所述等温扩增的时间为10~15min。优选的,所述扩增体系重溶后的体积为25~100μL,更优为5本文档来自技高网
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【技术保护点】
1.一种用于检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的特异性引物探针组,包括上游引物、下游引物和探针,其特征在于,所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示,所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示,所述探针为如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的特异性引物探针组,包括上游引物、下游引物和探针,其特征在于,所述上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示,所述下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示,所述探针为如SEQIDNO.3所示的核苷酸序列。


2.根据权利要求1所述的特异性引物探针组,其特征在于,所述探针为SEQIDNO.3所示的核苷酸序列的第31位碱基修饰荧光报告基团、第32位碱基替换为四氢呋喃残基和第34位碱基修饰荧光淬灭基团的物质。


3.根据权利要求2所述的特异性引物探针组,其特征在于,所述荧光报告基团包括FAM、HEX、TET、JOE、VIC、ROX、Cy3或Cy5;和/或所述荧光淬灭基团包括TAMRA、Eclipse、BHQ1、BHQ2、BHQ3或DABCYL。


4.含有权利要求1-3任一所述特异性引物探针组的试剂盒。


5.一种检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的RT-RAA荧光检测试剂盒,其特征在于,含有权...

【专利技术属性】
技术研发人员:马学军郭利川申辛欣蔡禹希王佶顾赛艺何小周应清界王智宏
申请(专利权)人:江苏奇天基因生物科技有限公司中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所
类型:发明
国别省市:江苏;32

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