一种用于粪便中细菌DNA快速提取的裂解液及方法技术

本发明专利技术提供了一种用于粪便中细菌DNA快速提取的裂解液及方法。该裂解液包含金属离子螯合剂、缓冲溶液、表面活性剂以及糖苷水解酶。使用本发明专利技术的裂解液提取粪便中细菌DNA，可以降低核酸的丢失并且大大减少交叉污染的产生，以获得高浓度的核酸，所获得的DNA可直接应用于核酸扩增反应。本发明专利技术所述的用于提取粪便中细菌DNA的方法操作简单方便、快速、成本低，可以为核酸扩增检测提供基础，为快速诊断胃肠道相关疾病提供支持，也减少了在确诊过程中的时间成本、经济成本，具有广阔的市场前景和较大的经济、社会效益，适于大范围推广应用。

A lysate and method for rapid extraction of bacterial DNA from feces

【技术实现步骤摘要】
一种用于粪便中细菌DNA快速提取的裂解液及方法
本专利技术属于核酸提取领域，具体涉及一种用于粪便中细菌DNA快速提取的裂解液，本专利技术还属于分子生物学和医学检测领域，其采用较为简便可靠的方法提取临床粪便样本中的细菌DNA，再采用核酸扩增技术对其进行检测。
技术介绍
从生物样本中分离纯化得到高质量的核酸是分子生物学实验非常关键的步骤。目前已报道了许多从生物样本中分离纯化核酸的方法，例如从血液、血浆、血清、培养细胞、植物、动物及人体组织等样本中分离提纯核酸的方法。而与血液或其他临床样本相比，粪便中复杂的微生物菌群、变化的一致性以及变化的内源性和膳食成分导致DNA提取特别困难。目前提取核酸的方法主要分为机械法、物理法和化学法；对于细菌中核酸的提取则主要是机械法中的研磨法，物理法中的冷热交替法以及化学法中的有机溶剂法、酶解法。一般情况下DNA的提取所用到的有机溶剂主要是强力变性剂如异硫氰胍或尿素-氯化锂等来溶解蛋白质，从而破坏细胞、病毒，并使核蛋白从核酸上解离下来，并灭活可能存在的RNA酶。并且在此基础上可采用硅藻、玻璃珠吸附和解吸附或有机溶剂抽提、乙醇(异丙醇)沉淀法提取核酸。这一方法是目前临床实验室常规应用的方法。有机溶剂法的原理是强力变性剂与硫基乙醇联合作用溶解蛋白灭活RNA酶，再加入乙酸钠、饱和酚、氯仿-异戊醇抽取以变性蛋白，经高速离心后得到上清，再以乙醇或异丙醇沉淀浓缩核酸再以75％乙醇洗涤沉淀和容器去除残余盐份，再经烘干去除残余乙醇，从而得到纯净的核酸。此种方法虽然能够有效去除蛋白、排除某些影响PCR反应的抑制剂的影响，并且能一定程度的浓缩核酸，但是其缺点也是不可忽视的，首先就是操作繁琐，并且在有机溶剂抽提后取上清的过程中必须小心谨慎，通常的小体积操作时很容易吸到或碰到导致实验失败的分层处的蛋白及有机溶剂；为了浓缩核酸，往往要加入一定量的助沉淀剂，有时会造成或大或小的影响；乙醇的洗涤过程仍属小心操作，以免沉淀的丢失；整个实验过程中需要多次离心，它极大地限制了单位时间内可处理的样品数，而某些步骤需要的精心操作，不仅限制了单位时间内可处理的样品数，增大了操作人员的劳动强度，而且使得实验的稳定性受到威胁。并且当大批量操作时可能还会存在交叉污染情况发生。目前核酸提取试剂盒中，常用的国外的提取试剂盒为凯杰(QIAGEN)公司生产的新型粪便基因组快速提取试剂盒(QIAampFastDNAStoolMiniKit)，(货号51604)；国内的提取试剂盒为天根生化科技(北京)有限公司生产的粪便基因组DNA提取试剂盒(货号DP328)。此外，还有非商业的常用方法-异硫氰酸胍/二氧化硅基质法。现有技术文献(McoristAL,JacksonM,BirdAR.AcomparisonoffivemethodsforextractionofbacterialDNAfromhumanfaecalsamples[J].JournalofMicrobiologicalMethods,2002,50(2):0-139)中使用四种商用试剂盒(FastDNAkit，Bio101；NucleospinRC+Tkit，Macherey-Nagal；QuantumPrepRAquapureGenomicDNAisolationkit,Bio-Rad；QIAampDNAstoolminikit，Qiagen)和非商业异硫氰酸胍/二氧化硅基质法对人类粪便样本中的细菌基因组进行提取，并比较了提取效果，并指出，QIAamp试剂盒是最有效的提取方法，该试剂盒具有更好的下游核酸扩增性能。综上所述，开发一种具有高效、污染少、操作简单方便等优势的DNA快速提取的裂解液及方法具有非常大的意义。
技术实现思路
为了解决现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种用于粪便中细菌DNA快速提取的裂解液，使用该裂解液可实现简单快速提取粪便样本中的细菌DNA。为实现上述目的，本专利技术提供了一种用于粪便中细菌DNA快速提取的裂解液，所述裂解液包括金属离子螯合剂、缓冲溶液、表面活性剂以及糖苷水解酶。在本专利技术所述的裂解液中，所述金属离子螯合剂为EDTA；优选地，所述EDTA的浓度为1-3mM；更优选地，浓度为2mM。在本专利技术所述的裂解液中，所述缓冲溶液为Tris-HCl(pH8.0)，所述Tris-HCl的浓度为10-20mM；更优选地，浓度为15mM。在本专利技术所述的裂解液中，所述表面活性剂为Tritonx-100，优选地，所述Tritonx-100的体积百分比为1％-3％；更优选地，体积百分比为2％。在本专利技术所述的裂解液中，优选地，所述糖苷水解酶为溶菌酶，所述溶菌酶的浓度为0.1-0.5mg/mL；更优选地，浓度为0.3mg/mL。本专利技术还提供了所述裂解液的制备方法，所述方法包括以下步骤：将金属离子螯合剂、缓冲溶液、表面活性剂、糖苷水解酶以及水配成混合液，并将该混合液用酸或者碱调节pH值为8.0，即得；优选地，所述水为超纯水；优选地，所述酸为HCl；优选地，所述碱为NaOH；优选地，所述方法包括以下步骤：将1-3mMEDTA、10-20mMTris-HCL(pH8.0)、1％-3％(体积百分比)Tritonx-100、0.1-0.5mg/mL溶菌酶以及水配成混合液，并将该混合液用酸或者碱调节pH值为8.0，即得。本专利技术的另一目的在于提供一种用于粪便中细菌DNA快速提取试剂盒，其包含本专利技术所述的裂解液。本专利技术的另一目的在于提供一种用于粪便中细菌DNA快速提取的方法，其包括以下步骤：(1)获取粪便样本，(2)将所述裂解液加入步骤(1)获得的粪便样本中，并提取DNA。优选地，所述方法包括以下步骤：(1)吸取粪便样本，离心并取上清液，将所述上清液离心并收集沉淀，即为粪便样本；(2)将所述的裂解液加入步骤(1)获得的粪便样本中，并提取DNA；或使用所述的DNA提取试剂盒提取DNA；其中，所述步骤(1)中的上清液与步骤(2)中的裂解液的体积比为4:1～4；优选地为4:2。根据本专利技术所述的方法，其中，所述步骤(1)包括：吸取1.2mL粪便样本至1.5mLEP管中后2000rpm、2min离心，在不吸取到沉淀的前提下将所有上清转移到新的1.5mLEP管，涡旋混匀后，取200μL上清12000rpm、2min离心弃上清，收集沉淀。优选地，所述步骤(2)包括：将100μL所述的裂解液加入到步骤(1)所收集的沉淀中，充分混匀，置于37℃金属浴中加热20min，加热完成后涡旋混匀后置于100℃金属浴中煮沸10min，将煮沸后的液体冷却后12000rpm、2min离心，所得上清即为分离获取的DNA。本专利技术所述的裂解液中，金属离子螯合剂EDTA能螯合二价金属并抑制DNA酶的活性，Tris-HCl能保证反应液PH值稳定在一定范围内，非离子型表面活性剂Tritonx-100以及能使细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于粪便中细菌DNA快速提取的裂解液，所述裂解液包括金属离子螯合剂、缓冲溶液、表面活性剂以及糖苷水解酶。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于粪便中细菌DNA快速提取的裂解液，所述裂解液包括金属离子螯合剂、缓冲溶液、表面活性剂以及糖苷水解酶。


2.根据权利要求1所述的裂解液，所述金属离子螯合剂为EDTA；优选地，所述EDTA的浓度为1-3mM；更优选地，浓度为2mM。


3.根据权利要求1或2所述的裂解液，所述缓冲溶液为Tris-HCl，所述Tris-HCl的浓度为10-20mM；更优选地，浓度为15mM。


4.根据权利要求1-3中任一项所述的裂解液，所述表面活性剂为Tritonx-100，优选地，所述Tritonx-100的体积百分比为1％-3％；更优选地，体积百分比为2％。


5.根据权利要求1-4中任一项所述的裂解液，所述糖苷水解酶为溶菌酶，所述溶菌酶的浓度为0.1-0.5mg/mL；更优选地，浓度为0.3mg/mL。


6.根据权利要求1-5中任一项的所述的裂解液的制备方法，所述方法包括以下步骤：
将金属离子螯合剂、缓冲溶液、表面活性剂、糖苷水解酶以及水配成混合液，并将该混合液用酸或者碱调节pH值为8.0，即得；
优选地，所述水为超纯水；
优选地，所述酸为HCl；
优选地，所述碱为NaOH；
优选地，所述方法包括以下步骤：
将1-3mMEDTA、10-20mMTris-HCL(pH8.0)、1％-3％(体积百分比)Tritonx-100、0.1-0.5mg/mL溶菌酶以及水配成混合液，并将该混合液用酸或者碱调节pH值为8.0，即得。


7.一种用...

【专利技术属性】
技术研发人员：蒋健晖，王海波，唐丽娟，
申请(专利权)人：湖南融健基因生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖南;43