一种适用于细菌和/或真菌的基因组DNA提取方法技术

本发明专利技术实施例涉及一种适用于细菌和/或真菌的基因组DNA提取方法，其包括以下步骤：除去临床标本中的液体部分以获得真菌和/或细菌的浓缩物；在获得的浓缩物中，加入适量的溶菌酶、溶壁酶和玻璃珠，混合；使细胞液中蛋白组分变性降解获得混合液；向混合液中加入磁珠使基因组DNA与磁珠结合，并分离磁珠；洗涤磁珠以去除杂质；洗脱磁珠上真菌和/或细菌的基因组DNA。本发明专利技术基因组DNA提取方法所加入的用于裂解真菌细胞壁的溶壁酶不会影响细菌基因组DNA的提取，所加入的用于裂解细菌细胞壁的溶菌酶不会影响真菌基因组DNA的提取。

A method of genomic DNA extraction for bacteria and / or fungi

【技术实现步骤摘要】
一种适用于细菌和/或真菌的基因组DNA提取方法
本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种适用于细菌和/或真菌的基因组DNA提取方法。
技术介绍
细菌以及真菌在环境中普遍存在，在特定的条件下(如意外伤口，手术，使用呼吸机等)其可进入人体的血液循环系统、泌尿系统，下呼吸道，中枢神经系统等，从而产生比较严重感染甚至致死。由于细菌细胞壁的主要组分是肽聚糖，而真菌细胞壁的主要成分是几丁质，二者的细胞壁破碎方式有所不同。因此在现有技术中是用提取细菌基因组DNA的试剂盒来提取细菌基因组DNA，用提取真菌基因组DNA的试剂盒来提取真菌基因组DNA，二者相互独立提取，现有技术中缺乏能同时适用于细菌和真菌的基因组DNA提取方法。另外，不同种类和来源的临床标本如：血液、脑脊液、下呼吸道灌洗液和尿液中，细菌及真菌的含量差异较大(102-108CFU/mL)。当临床标本中细菌或真菌的含量相对较高时，可以直接提取其基因组DNA；当临床标本中细菌或真菌的含量相对较低时，需要将标本中的细菌或真菌培养至一定浓度后(如：1.5×108CFU/mL)，再进行基因组DNA提取分析。但是由于临床标本中细菌或真菌的含量未知，因此在临床标本取样后都会进行常规的体外培养以确保基因组DNA提取能正常进行。体外培养使得对临床标本进行检测所需的整体时间大大延长，并且临床标本中的抑制物质(如抗菌药物)干扰常会导致其中细菌的体外培养失败，从而使得检验结果不准确或灵敏度不高。磁珠法提取核酸是利用了磁珠在不同盐离子种类或浓度及不同pH条件下对DNA的选择性结合。并且由于磁珠本身具有磁性，容易被捕获和释放，因此易于在采用自动化操作的设备上实施，从而降低了操作过程中的人为误差因素，适用于大批量标本的核酸提取。公开于该
技术介绍
部分的信息仅仅旨在增加对本专利技术的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
技术实现思路
专利技术目的本专利技术的目的在于提供一种适用于细菌和/或真菌的基因组DNA提取方法，该提取方法结合了酶法、玻璃珠破碎法等相关实用操作技术以释放基因组DNA，并以磁珠为介质，从临床标本中提取细菌和/或真菌的基因组DNA，该方法既适用于细菌又适用于真菌，所加入的用于裂解真菌细胞壁的溶壁酶不会影响细菌基因组DNA的提取，所加入的用于裂解细菌细胞壁的溶菌酶不会影响真菌基因组DNA的提取。当化验人员需要对临床样本中的菌株进行基因组DNA提取时，无需区分其是细菌还是真菌，都可以采用本专利技术基因组DNA提取方法，即该方法既方便了化验人员，也降低了其出错的可能性。解决方案为实现本专利技术目的，本专利技术实施例提供了一种适用于细菌和/或真菌的基因组DNA提取方法，其包括以下步骤：除去临床标本中的液体部分以获得真菌和/或细菌的浓缩物；在获得的浓缩物中，加入适量的溶菌酶、溶壁酶和玻璃珠，混合，以裂解浓缩物中所含真菌和/或细菌细胞的细胞壁获得细胞液；使细胞液中蛋白组分变性降解以释放基因组DNA获得混合液；向混合液中加入磁珠使基因组DNA与磁珠结合，并分离磁珠；洗涤磁珠以去除杂质；洗脱磁珠上真菌和/或细菌的基因组DNA。在另一种可能的实现方式中，所述临床标本中细菌和/或真菌浓度为1.0×102-8CFU/ml，可选地为1.0×102-6CFU/ml，进一步可选地为1.0×102-5CFU/ml，更进一步可选地为1.0×102-4CFU/ml，再更进一步可选地为1.0×102-3CFU/ml。在另一种可能的实现方式中，所述临床标本未经过体外的细菌和/或真菌培养。直接进行细菌基因组DNA和/或真菌基因组DNA的提取。在另一种可能的实现方式中，所述临床标本包括血液，泪液，脑脊液，胸腔积水，腹腔积水，肺泡灌洗液，尿液，鼻咽拭子，脓液，脓液，精液。这些临床标本主要分为两大类别，一种是含有红细胞的标本，如全血标本；另一种是不含有组织细胞的体液标本，如：脑脊液，尿液，胸腹腔积水，肺泡灌洗液等。同时其他的临床标本，如：咽拭子，脓液等也同样适用本方法。在另一种可能的实现方式中，除去临床标本中的液体部分以获得真菌和/或细菌的浓缩物的操作包括：12000rpm离心5分钟，吸取抛弃上清。在另一种可能的实现方式中，含有红细胞的临床标本在除去液体部分前还包括在抗凝临床标本中加入红细胞裂解液以裂解红细胞的步骤。在另一种可能的实现方式中，所述细菌包括金黄色葡萄球菌、脑膜炎奈瑟菌、肺炎克雷伯菌，所述真菌包括光滑念珠菌、隐球菌。在另一种可能的实现方式中，在每500-1000μl初始体积的临床样本所获得的细菌和/或真菌沉淀浓缩物中，加入溶菌酶30-50mg、溶壁酶50-150U和直径分布为0.1-3mm的玻璃珠50-150mg。在另一种可能的实现方式中，在每500-1000μl初始体积的临床样本所获得的细菌和/或真菌沉淀浓缩物中，加入溶菌酶40mg、溶壁酶100U和直径分布为0.1-3mm的玻璃珠100mg。在另一种可能的实现方式中，所述磁珠为表面携带有硅羟基或者羧基基团的磁珠。在另一种可能的实现方式中，向混合液中加入磁珠使基因组DNA与磁珠结合时，还加入结合液；可选地，结合液包含1.0-5.0M高氯酸钠，0.1-4.0M乙酸钠和水。在另一种可能的实现方式中，提取的细菌基因组DNA和/或真菌基因组DNA适用于PCR分析、基因序列直接测定、二代测序、基因芯片检测；所述PCR分析包括荧光定量PCR分析或数字PCR分析。有益效果(1)本专利技术基因组DNA提取方法结合了酶法、玻璃珠破碎法等相关实用操作技术以释放基因组DNA，并以磁珠为介质，从临床标本中提取细菌和/或真菌的基因组DNA，该方法既适用于细菌又适用于真菌，所加入的用于裂解真菌细胞壁的溶壁酶不会影响细菌基因组DNA的提取，所加入的用于裂解细菌细胞壁的溶菌酶不会影响真菌基因组DNA的提取。当化验人员需要对临床样本中的菌株进行基因组DNA提取时，无需区分其是细菌还是真菌，都可以采用本专利技术基因组DNA提取方法，即该方法既方便了化验人员，也降低了其出错的可能性。同时该基因组DNA提取方法对于临床标本中的高浓度细菌、真菌以及低浓度细菌、真菌(1.0×102-3CFU/ml)的基因组DNA提取，均适用，可以对浓度为1.0×102-8CFU/ml的细菌和/或真菌进行核酸提取。(2)本专利技术基因组DNA提取方法尤其适用于所含细菌和/或真菌浓度低的临床标本，可以对浓度为1.0×102-6CFU/ml、1.0×102-5CFU/ml、1.0×102-4CFU/ml、1.0×102-3CPF/ml的细菌和/或真菌进行核酸提取，使得该方法的适用范围广。(3)本专利技术基因组DNA提取方法适用于确诊病人或疑似病人的临床样本，又由于可以适用于所含细菌和/或真菌浓度低的临床标本，因此无需对临床标本进行体外的细菌和/或真菌培养，而是可直接进行细菌和/或真菌基因组DNA的提取本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种适用于细菌和/或真菌的基因组DNA提取方法，其特征在于，包括以下步骤：/n除去临床标本中的液体部分以获得真菌和/或细菌的浓缩物；/n在获得的浓缩物中，加入适量的溶菌酶、溶壁酶和玻璃珠，混合，以裂解浓缩物中所含真菌和/或细菌细胞的细胞壁获得细胞液；/n使细胞液中蛋白组分变性降解以释放基因组DNA获得混合液；/n向混合液中加入磁珠使基因组DNA与磁珠结合，并分离磁珠；/n洗涤磁珠以去除杂质；/n洗脱磁珠上真菌和/或细菌的基因组DNA。/n

【技术特征摘要】
1.一种适用于细菌和/或真菌的基因组DNA提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
除去临床标本中的液体部分以获得真菌和/或细菌的浓缩物；
在获得的浓缩物中，加入适量的溶菌酶、溶壁酶和玻璃珠，混合，以裂解浓缩物中所含真菌和/或细菌细胞的细胞壁获得细胞液；
使细胞液中蛋白组分变性降解以释放基因组DNA获得混合液；
向混合液中加入磁珠使基因组DNA与磁珠结合，并分离磁珠；
洗涤磁珠以去除杂质；
洗脱磁珠上真菌和/或细菌的基因组DNA。


2.根据权利要求1所述的基因组DNA提取方法，其特征在于：所述临床标本中细菌和/或真菌浓度为1.0×102-8CFU/ml，可选地为1.0×102-6CFU/ml，进一步可选地为1.0×102-5CFU/ml，更进一步可选地为1.0×102-4CFU/ml，再更进一步可选地为1.0×102-3CFU/ml。


3.根据权利要求1所述的基因组DNA提取方法，其特征在于：所述临床标本未经过体外的细菌和/或真菌培养。


4.根据权利要求1所述的基因组DNA提取方法，其特征在于：所述临床标本包括血液，泪液，脑脊液，胸腔积水，腹腔积水，肺泡灌洗液，尿液，鼻咽拭子，脓液，脓液，精液。


5.根据权利要求1所述的基因组DNA提取方法，其特征在于：除去临床标本中...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘瑞鑫，王玲，闫宝山，于大为，邵育晓，徐悦，樊高君，
申请(专利权)人：北京贝尔生物工程股份有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11