一种检测传染性胰脏坏死病毒的引物和探针及试剂盒与检测方法技术

本发明专利技术公开了一种检测传染性胰脏坏死病毒的引物和探针及试剂盒与检测方法，引物的上、下游引物对和探针的序列分别为：上游引物序列5’‑ATACGTCCGCCTWGAGGA‑3’、下游引物序列5’‑GGATGGGAGGTCGATYTC‑3’、探针序列5’‑GATGAGGTGCACAGCTGC‑3’。含有上述引物和探针的试剂盒用于检测鱼苗、鱼卵、鱼体中是否感染了传染性胰脏坏死病毒。本发明专利技术的引物和探针具有更高的特异性、灵敏度、实用性及便捷性，能有效的对传染性胰脏坏死病毒进行高灵敏的检测。

【技术实现步骤摘要】
一种检测传染性胰脏坏死病毒的引物和探针及试剂盒与检测方法
本专利技术属于水产病害微生物检测
，具体涉及一种检测传染性胰脏坏死病毒的引物和探针及试剂盒与检测方法。
技术介绍
传染性胰脏坏死病(Infectiouspancreaticnecrosis,IPN)是一种主要危害鲑鳟鱼类的严重病毒性传染病，可造成鲑鳟养殖业重大经济损失，其病原为二十面体对称，无囊膜，直径为50～75nm的双链RNA病毒，即传染性胰脏坏死病毒(Infectiouspancreaticnecrosisvirus,IPNV)。IPNV可以通过鱼卵垂直传播，也可通过带毒水体、网具、患鱼的排泄物进行水平传播。感染耐过的鱼可产生抵抗力不再发病，但可终身带毒，依然具备传染性。由于宿主、毒株和环境因素的不同，IPNV可造成10％～90％的死亡率。临床症状包括体色发黑、眼球突出、肛门红肿、胰脏坏死、肾脏肿大等。该病原是口岸水生动物及其产品的重要检疫对象之一以及农业农村部规定的重要疫病监测对象。IPN是一种严重的鱼类急性传染病，流行范围涉及亚洲、欧美、美洲多个国家，1986年传入我国，已给我国多省份鲑鳟养殖产业造成巨大经济损失。目前，针对该类病毒病尚以预防为主，并没有有效的治疗措施，尽快确诊病原，尽早切断传播途径对降低经济损失有重要作用。目前在我国检测IPNV的标准是GB/T15805.1-2008，该标准采用病毒分离培养、中和试验、酶联免疫等3种检测方法，操作步骤较为复杂繁琐，且耗时长。分子生物学检测方法是实验室常用的病原检测方法，其中实时荧光定量RT-PCR具有灵敏度高、特异性强和重复性好等优点,已成为动物病原检测的重要方法。IPNV基因组共编码五种蛋白，即A片段的VP2蛋白、VP3蛋白、VP4蛋白、VP5蛋白以及B片段编码的VP1蛋白。其中，VP2蛋白是病毒的主要结构蛋白，携带病毒毒力的因子，含有适应细胞培养的反应因子，常作为IPNV的诊断以及疫苗研究的主要靶点。根据VP2蛋白的氨基酸序列，IPNV又可分为6个基因型和10种血清型，针对所有基因型代表序列的保守区域设计通用引物，建立分子生物学检测方法则相对困难，这也是IPNV国家标准检测方法不包括分子生物学检测的重要原因。目前，已有的中和试验、酶联免疫吸附试验等免疫学检测方法耗时较长，操作繁琐，不适用与IPNV的快速诊断。刘兴发等、Lopez-JimenaB等、SangPS等、吴斌等、刘淼等先后建立了RT-PCR方法，有效缩短了检测时间，且操作简单，为IPNV的诊断提供了重要参考，但方法的通用性还有待验证。与RT-PCR相比，实时荧光定量RT-PCR可显著缩短检测时间，具有快速、特异、灵敏等优点，在样品量非常大时具有很大优势。更适用于IPNV的快速诊断，可为尽早切断病毒传播途径提供有力的技术支撑。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是，提供一种检测传染性胰脏坏死病毒的引物和探针及试剂盒与检测方法，提高检测效率，尽快确诊病原，对IPNV建立了实时荧光定量RT-PCR方法。为了解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案是：一种检测传染性胰脏坏死病毒的引物和探针，引物的上、下游引物对和探针的序列分别为：上游引物序列5’-ATACGTCCGCCTWGAGGA-3’SEQIDNO:1下游引物序列5’-GGATGGGAGGTCGATYTC-3’SEQIDNO:2探针序列5’-GATGAGGTGCACAGCTGC-3’SEQIDNO:3。一种检测传染性胰脏坏死病毒的试剂盒，所述的试剂盒包含上述的引物和探针。一种采用上述试剂盒检测传染性胰脏坏死病毒的检测方法，用于检测鱼苗、鱼卵、鱼体中是否感染了传染性胰脏坏死病毒，包括如下的步骤：1)提取待检测样品的核酸作为检测的模板；2)将提取的RNA进行反转录制备cDNA；3)进行检测样品的PCR扩增，反应体系20μL，包含有2×ProbePCRMasterMix,0.6μmol/L的上下游引物，0.3μmol/L的探针，ROX参考染料，步骤2)制备的cDNA作为扩增模板；PCR扩增的反应程序如下：95℃2min；95℃5s，54℃30s，40个循环。步骤3)中同时进行阳性对照和阴性对照扩增；阳性对照为传染性胰脏坏死病毒核酸片段的反转录cDNA，阴性对照为去离子水。本专利技术的有益效果是：本专利技术的引物和探针具有更高的特异性、灵敏度、实用性及便捷性，能有效的对传染性胰脏坏死病毒进行高灵敏的检测。附图说明图1是本专利技术的IPNV的敏感性曲线(1～9为1×109拷贝/μL～1×101拷贝/μL；10.空白对照)；图2是本专利技术的标准曲线；图3是本专利技术的特异性曲线(1.传染性胰脏坏死病毒；2.传染性造血器官坏死病毒；3.鲤春病毒血症病毒；4.病毒性出血性败血症病毒；5.草鱼呼肠孤病毒；6.流行性造血器官坏死病毒；7.空白对照)。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述；显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。实施例1：引物和探针的设计和筛选通过网络，登陆GenBank数据库，查询检索已公布的传染性胰脏坏死病毒的6个基因簇(Genogroup1-6)的代表核苷酸序列，用DNAMAN软件对序列进行同源性比对分析，确定保守区域，作为引物和TaqMan探针序列设计的主要靶点。采用PrimerPremier6.0设计5组引物及探针，同时对△G值、引物长度和GC含量等引物设计指标进行评估，选择分数较高的引物探针进行后续试验。上游引物序列5’-ATACGTCCGCCTWGAGGA-3’、下游引物序列5’-GGATGGGAGGTCGATYTC-3’、探针序列5’-GATGAGGTGCACAGCTGC-3’。实施例2：引物探针检测浓度测定采用20μl反应体系，2×ProbePCRMasterMix10μl，上、下游引物浓度设定为0.2μM～1.0μM，探针浓度设定为0.1μM～0.5μM，QNROX参考染料0.1μl，浓度为1×103～1×105copies/μL的质粒模板2.5μl，DEPC水补足20μl。反应程序：95℃2min；95℃5s，56℃30s，40个循环，进行了实时荧光定量PCR扩增。根据荧光PCR结果曲线和Ct值确定最佳检测浓度。扩增结果显示，当上、下游引物浓度从0.2μM增至0.6μM，探针浓度从0.1μM增至0.3μM时，Ct值呈下降趋势。当上、下游引物浓度从0.6μM增至1.0μM，探针浓度从0.3μM增至0.5μM时，Ct值不再降低，基本保持同一水平。因此，本专利技术中选择的引物终浓度为0.6μM，探针最佳终浓度为0.3μM。见下表。引物和探针检测浓度优化结果实施例3：引物探针退火温度确本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测传染性胰脏坏死病毒的引物和探针，其特征在于，引物的上、下游引物对和探针的序列分别为：/n上游引物序列 5’-ATACGTCCGCCTWGAGGA-3’ SEQ ID NO:1/n下游引物序列 5’-GGATGGGAGGTCGATYTC-3’ SEQ ID NO:2/n探针序列 5’-GATGAGGTGCACAGCTGC-3’ SEQ ID NO:3。/n

【技术特征摘要】
1.一种检测传染性胰脏坏死病毒的引物和探针，其特征在于，引物的上、下游引物对和探针的序列分别为：
上游引物序列5’-ATACGTCCGCCTWGAGGA-3’SEQIDNO:1
下游引物序列5’-GGATGGGAGGTCGATYTC-3’SEQIDNO:2
探针序列5’-GATGAGGTGCACAGCTGC-3’SEQIDNO:3。


2.一种检测传染性胰脏坏死病毒的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包含有权利要求1所述的引物和探针。


3.一种采用权利要求2所述试剂盒检测传染性胰脏坏死病毒的检测方法，其特征在于，用于检测鱼苗、鱼卵、鱼体中是否感染了传染性胰脏...

【专利技术属性】
技术研发人员：张文，徐立蒲，吕晓楠，王小亮，曹欢，王静波，王姝，
申请(专利权)人：北京市水产技术推广站，
类型：发明
国别省市：北京;11