本发明专利技术公开了一种鲤浮肿病毒的原位杂交检测探针及其应用，属于疫病检测技术领域。所述探针的序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示，经FAM标记的探针可用于检测鲤浮肿病毒，也可以用于制备鲤浮肿病毒检测试剂盒。所述的探针与组织切片中的CEV P4a基因特异性杂交结合，所以较常规的染色检测更为灵敏、精准，还可根据样本切片分析CEV感染的阳性率和感染部位及程度。率和感染部位及程度。
【技术实现步骤摘要】
一种鲤浮肿病毒的原位杂交检测探针及其应用
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[0001]本专利技术涉及分子生物学及水产养殖业水生动物疫病检测
，具体涉及一种鲤浮肿病毒的原位杂交检测探针及其应用。
技术介绍
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[0002]鲤浮肿病(Carp edema virus disease，CEVD)，也称锦鲤昏睡病(koi sleepy disease,KSD)，是由一种痘病毒鲤浮肿病毒(Carp edema virus，CEV)感染鲤、锦鲤引起的高度传染性流行病。患病鱼常出现烂鳃、凹眼、昏睡等症状，疾病导致的死亡率高达80
‑
100％，给水产养殖业造成严重经济损失。该病已在全球迅速蔓延，我国在2016年首次报道发生CEVD，是我国水生动物的一种新发疫病。
[0003]目前对CEV引起的鲤浮肿病尚无有效的治疗方法，只能以预防为主。因此建立准确、快速的现地检测方法，是有效防控CEVD的保障。由于CEV尚无易感细胞系，其检测方法主要依赖于套式PCR、荧光PCR等分子生物学方法。PCR检测虽然简单，灵敏度高，但不能直观的观察和证明CEV，而且易于因操作中的模板污染而出现假阳性。原位杂交假阳性率低，从而直观性、准确性和灵敏性综合考虑是一种其他任何方法都无法替代的检测方法，但至今未见有CEV的原位杂交检测方法。
技术实现思路
：
[0004]本专利技术所要解决的技术问题是，提供一种鲤浮肿病毒的原位杂交检测探针及其应用，根据鲤浮肿病毒编码P4a蛋白的保守序列设计合成3条DNA探针，可用于鲤浮肿病毒的原位杂交检测，具有优异的直观性、准确度和灵敏度。
[0005]本专利技术根据CEV P4a基因序列设计3条DNA探针，以FAM进行标记，制备鲤浮肿病毒的原位杂交检测探针。
[0006]鲤浮肿病毒的原位杂交检测探针，其特征在于，包含以下核苷酸序列的3条探针：
[0007]探针1：5
’‑
GCCCAAGAGTTTTCTTCTCATCGTTTGTTACC
‑3’
SEQ ID NO:1
[0008]探针2：5
’‑
GCAACTCCTTGAGGAATATGATCTAGAATTCC
‑3’
SEQ ID NO:2
[0009]探针3：5
’‑
GAACATAACATTTGCAATTTTAACTTGCTCTGG
‑3’
SEQ ID NO:3
[0010]所述探针1、探针2、探针3在5
’
端修饰FAM。
[0011]所述的探针可用于检测鲤浮肿病毒，也可以用于制备鲤浮肿病毒检测试剂盒，试剂盒中还包括原位杂交检测试剂。
[0012]具体地，所述的鲤浮肿病毒检测试剂盒包括：上述原位杂交检测探针、蛋白酶K、预杂交液。检测方法如下：
[0013]所述鲤浮肿病毒检测试剂盒的使用方法，其特征在于，包含以下步骤：
[0014](1)切片经热修复煮沸15分钟，滴加蛋白酶K(20μl/ml)室温消化20min，蒸馏水洗一次，PBS洗5min
×
3次；
[0015](2)滴加预杂交液淹没，置于恒温42℃培养箱中2
‑
3h；
[0016](3)吸去多余液体后，滴加原位杂交检测探针混合液淹没切片，恒温37℃过夜；所述的原位杂交检测探针混合液，是将探针1、探针2、探针3溶解于可溶解的溶液(优选预杂交液)中，探针1、探针2、探针3的摩尔比为1：1：1，且工作时三种探针的总浓度为1.0μg/ml；
[0017](4)37℃条件下经梯度SSC洗涤即2
×
SSC洗涤10min，1
×
SSC洗涤10min
×
2次，0.5
×
SSC洗涤10min
×
1次；
[0018](5)滴加DAPI避光孵育5min，进行染核，用PBS冲洗多余的DAPI；最后50％缓冲甘油(50％缓冲甘油：甘油和PBS的质量比1：1)封片，并在显微镜下拍照观察；
[0019](6)结果判定：荧光激发后CEV感染部位呈绿色荧光，细胞核经DAPI染成蓝色荧光。
[0020]与现有技术相比，本专利技术具有以下优点及有益效果：
[0021](1)能够直观地将CEV病原与其引起的组织病理学变化结合起来，从而确定CEV感染部位、感染程度，了解其致病力；
[0022](2)能高效、准确的检测CEV，同时能对CEV进行定位，并且可根据样本切片分析CEV感染的阳性率和感染强度，这是其他分子生物学检测方法所不具备的特点；
[0023](3)由于探针和CEV P4a基因的杂交是特异性的，所以较常规的染色检测更为灵敏、精确；
[0024](4)在本方法中，切片可以长期避光保存。
附图说明：
[0025]图1，CEV感染镜鲤心、肝、脾、肾、脑、皮肤、鳃组织的原位杂交染色(100X)(图中的箭头仅是指出鳃组织中的特异性结合，其他的没有特别用箭头指出)。
具体实施方式：
[0026]下面结合附图和具体实施方式对本专利技术作进一步详细说明，但本专利技术并不限于以下实施例。
[0027]以下实施例中所用的材料、试剂等，无特殊说明，均为常规方法。
[0028]以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0029]以下实例中预杂交液为武汉博士德公司。
[0030]以下实例中DAPI为南京凯基生物科技发展有限公司产品。
[0031]以下实例中的探针由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
[0032]1.探针的设计
[0033]根据CEV P4a蛋白的一段保守序列设计了3条特异性探针(SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3)，并在3条探针的5
’
端标记FAM。
[0034]本专利技术所述的探针混合液中，所述的探针碱基序列如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3所示，其摩尔配比为1:1:1。3条探针在5
’
端修饰FAM。
[0035]2.组织样品处理
[0036]将疑似感染鲤浮肿病的濒死镜鲤现场剖检，观察临床症状。选取具有烂鳃、眼球凹陷、体表糜烂出血等临床症状明显的病鱼。分别取心、肝、脾、肾、脑、皮肤、鳃，用4％多聚甲醛固定。固定48h后，进行常规脱水、透明、浸蜡、包埋，后续切片5μm厚的连续切片。组织切片，进行常规脱蜡水化，于PBS洗涤3次，每次5分钟。
[0037]3.CEV原位杂交检测
[0038]切片经热修复煮沸15分钟，滴加蛋白酶K(20μl/ml)室温消化20min，蒸馏水洗一次，PBS洗5min
×
3次。滴加50μL预杂交液，置于恒温42℃培养箱中2
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3h。吸去多余液体后，滴加100μL原位杂交检测探针混合液，恒温37℃培过本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.鲤浮肿病毒的原位杂交检测探针，其特征在于，包含以下核苷酸序列的3条探针：探针1：5
’‑
GCCCAAGAGTTTTCTTCTCATCGTTTGTTACC
‑3’
SEQ ID NO:1探针2：5
’‑
GCAACTCCTTGAGGAATATGATCTAGAATTCC
‑3’
SEQ ID NO:2探针3：5
’‑
GAACATAACATTTGCAATTTTAACTTGCTCTGG
‑3’
SEQ ID NO:3。2.根据权利要求1所述鲤浮肿病毒的原位杂交检测探针，其特征在于，所述探针1、探针2、探针3在5
’
端修饰FAM。3.含有权利要求1
‑
2任一项所述鲤浮肿病毒的原位杂交检测探针的鲤浮肿病毒检测试剂盒。4.根据权利要求3所述的鲤浮肿病毒检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒为原位杂交检测试剂盒，含有权利要求1
‑
2任一项所述原位杂交检测探针、蛋白酶K、预杂交液。5.权利要求4所述鲤浮肿病毒检测试剂盒的使用方法，其特...
【专利技术属性】
技术研发人员：吕晓楠，徐立蒲，张文，曹欢，王小亮，王姝，王静波，
申请(专利权)人：北京市水产技术推广站，
类型：发明
国别省市：
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